谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的朱砂葉螨對(duì)炔螨特抗藥性研究.pdf

1、朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus(Boisduval)屬蛛形綱Arachnida蜱螨目Acarina葉螨科Tetranychidae葉螨屬Tetranychus，是一種寄主廣泛的世界性重要害螨，危害包括棉花、花卉、果樹和蔬菜在內(nèi)的多種植物，朱砂葉螨也是桑園重要的植食性害螨，近年來，發(fā)生危害日益嚴(yán)重。目前化學(xué)防治仍是害螨的主要防控手段，但由于螨類繁殖力強(qiáng)、世代周期短等自身特點(diǎn)，以及不合理使用殺蟲殺螨劑，導(dǎo)致其抗藥性問

2、題日趨嚴(yán)重，已經(jīng)發(fā)展成為世界上抗藥性最嚴(yán)重的害螨之一。
　　作為一種傳統(tǒng)的殺螨劑，炔螨特具有高效、低毒、廣譜的特點(diǎn)，自1964年推出以來便被廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)林害螨的防治。雖然長(zhǎng)期使用該藥劑，但抗藥性監(jiān)測(cè)表明橘全爪螨、朱砂葉螨等螨類對(duì)炔螨特并未產(chǎn)生抗性。未來幾年內(nèi)，炔螨特仍是螨類防控的主打藥劑之一。目前，對(duì)該藥劑的研究主要集中在農(nóng)藥殘留和環(huán)境毒理學(xué)等方面，而關(guān)于害蟲對(duì)炔螨特的抗藥性卻沒有系統(tǒng)研究報(bào)道。因此，深入了解炔螨特的作用機(jī)理，

3、評(píng)估螨類對(duì)該藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)害蟲害螨抗藥性產(chǎn)生機(jī)制和治理對(duì)策的深入研究具有重要的基礎(chǔ)作用。
　　本學(xué)位論文以重要害螨朱砂葉螨為研究對(duì)象，針對(duì)螨類防治中可能出現(xiàn)的抗藥性這一農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際問題，開展對(duì)云南桑園朱砂葉螨不同種群的抗藥性測(cè)定，首次明確了云南桑園朱砂葉螨抗藥性水平;在室內(nèi)選育了朱砂葉螨炔螨特抗性品系，并對(duì)其抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力和抗性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行估測(cè)，揭示了朱砂葉螨對(duì)炔螨特的抗性發(fā)展規(guī)律;在基于對(duì)抗性品系生理生化特性分析的基礎(chǔ)上，明確了

4、以朱砂葉螨體內(nèi)重要解毒代謝酶系GSTs作為炔螨特代謝抗性主導(dǎo)因子，并進(jìn)一步開展了其分子生物學(xué)特性分析，克隆了朱砂葉螨GSTS基因，比較分析抗性和敏感品系mRNA水平表達(dá)差異，進(jìn)行了異源表達(dá)研究。從種群生物學(xué)到分子生物學(xué)綜合分析朱砂葉螨對(duì)炔螨特抗性機(jī)制，明確了以GSTs介導(dǎo)的朱砂葉螨對(duì)炔螨特代謝抗性機(jī)制，對(duì)解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問題和豐富農(nóng)業(yè)害蟲害螨抗藥性研究理論等都具有實(shí)際意義。通過三年多的研究工作，主要取得以下研究結(jié)果:
　　1.云南桑園

5、朱砂葉螨不同種群抗藥性測(cè)定
　　根據(jù)國(guó)際殺蟲劑抗性委員會(huì)（InsecticideResistanceActionCommittee，IRAC）對(duì)殺蟲殺螨劑作用機(jī)制分類，選擇5類7個(gè)常用藥劑，采用FAO(1980)推薦的玻片浸漬法(Slide-dipmethod)對(duì)云南7個(gè)蠶桑主產(chǎn)區(qū)桑園朱砂葉螨種群進(jìn)行抗藥性測(cè)定，并檢測(cè)了主要代謝解毒酶羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450)的活性及

6、動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，云南桑園朱砂葉螨種群總體上對(duì)7種藥劑仍處于低到中抗水平。蒙自和祥云朱砂葉螨田間種群對(duì)辛硫磷的相對(duì)抗性倍數(shù)分別為31.45和26.22，已達(dá)到中等抗性水平;陸良、蒙自、鶴慶和巧家田間朱砂葉螨種群對(duì)溴蟲腈的相對(duì)抗性倍數(shù)分別為22.52、19.05、16.28和14.98，達(dá)到低抗水平。朱砂葉螨各地方種群對(duì)阿維菌素比較敏感;各田間種群對(duì)長(zhǎng)期使用的敵敵畏、滅多威、噠螨靈和炔螨特的抗性倍數(shù)在10倍以下，說明上仍可作用于桑樹上

7、。將朱砂葉螨田間種群對(duì)常用殺蟲殺螨劑的相對(duì)抗性比進(jìn)行Spearman'srank相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，阿維菌素和滅多威呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.857)，這對(duì)田間藥劑輪用具有重要參考價(jià)值。分別比較朱砂葉螨各田間種群CarE、GSTs和P450比活力與敏感品系相對(duì)比值發(fā)現(xiàn)，GSTs比值范圍在6.44-117.96之間，CarE為1.53-29.87倍，P450為1.12-2.67倍，各田間種群體內(nèi)GSTs和CarE的活性相對(duì)較高。
　　2

8、.朱砂葉螨炔螨特抗性品系的選育及抗性特點(diǎn)
　　2.1朱砂葉螨炔螨特抗性品系的選育
　　以2000年采自重慶北碚區(qū)田間，對(duì)在室內(nèi)未接觸任何藥劑飼養(yǎng)10多年的朱砂葉螨敏感品系進(jìn)行抗藥性篩選，選育朱砂葉螨炔螨特抗性品系。經(jīng)炔螨特不連續(xù)(F1-F23)和連續(xù)(F24-F34)篩選共34代后，得到炔螨特相對(duì)抗性品系，其抗性倍數(shù)達(dá)30.669。在炔螨特選擇壓力下，朱砂葉螨產(chǎn)生抗性的速率較慢，截止汰選至第34代，其毒力回歸方程的斜率b值逐

9、漸減小。分析炔螨特選育過程中不同選育方式（連續(xù)用藥與不連續(xù)用藥）對(duì)炔螨特抗性進(jìn)化的影響發(fā)現(xiàn)，不連續(xù)用藥篩選(F1-F23)23代現(xiàn)實(shí)遺傳力（h2）為0.047，連續(xù)篩選（F24-F34）10代的現(xiàn)實(shí)遺傳力（h2）為0.055，連續(xù)藥劑選擇壓力下的朱砂葉螨對(duì)炔螨特的現(xiàn)實(shí)遺傳力（h2）大于不連續(xù)用藥的抗性遺傳力。連續(xù)藥劑選擇壓力下的朱砂葉螨對(duì)炔螨特的抗性進(jìn)化速率高于不連續(xù)用藥選擇。根據(jù)現(xiàn)實(shí)遺傳力預(yù)測(cè)抗性提高10倍出現(xiàn)的時(shí)間，若藥劑防治平均殺

10、死率為50％-90％時(shí)，在不連續(xù)藥劑情況下，朱砂葉螨抗性提高10倍需要53-21代，連續(xù)用藥則需要46-18代。
　　2.2朱砂葉螨炔螨特抗性品系的相對(duì)適合度
　　采用葉碟飼養(yǎng)法組建朱砂葉螨敏感品系(F0)和抗性品系(F34)的生命生殖力表，進(jìn)行種群參數(shù)和適合度分析。朱砂葉螨經(jīng)炔螨特篩選34代后，其抗性倍數(shù)達(dá)30.669倍，與敏感品系相比，炔螨特抗性品系卵期、若螨期和產(chǎn)卵前期延長(zhǎng)，幼螨期縮短，在整個(gè)世代歷期上，完成世代大概需

11、要11.117d，敏感品系為10.581d，無顯著差異。抗性品系每雌產(chǎn)卵量少于敏感品系，卵孵化率低于敏感品系，但差異并不顯著。種群參數(shù)分析表明，抗性品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm)為0.243，略低于敏感品系(0.257)，抗性品系的凈生殖率（Rn）為28.990，略高于敏感品系(25.342)。以Rn比值比較朱砂葉螨抗性品系的適合度，抗性品系適合度為1.144，與敏感品系無明顯差異，表明朱砂葉螨敏感品系經(jīng)過炔螨特篩選后形成的抗性品系(F34)

12、并未出現(xiàn)適合度缺陷。
　　2.3朱砂葉螨對(duì)炔螨特抗性生化機(jī)制
　　使用玻片浸漬法(Slide-dipmethod)分別對(duì)炔螨特抗性選育過程中的朱砂葉螨F26(RR=10.80)和F34（RR=30.669）進(jìn)行交互抗性測(cè)定，結(jié)果顯示在抗性篩選過程中，朱砂葉螨炔螨特抗性品系對(duì)辛硫磷、噠螨靈和溴蟲腈表現(xiàn)出不同程度的交互抗性，對(duì)丁醚脲、敵敵畏和阿維菌素未產(chǎn)生明顯的交互抗性。
　　在酶特異性抑制實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用玻片浸漬法(Slid

13、e-dipmethod)分別測(cè)定了敏感品系和抗性品系(F34)雌成螨中，羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和細(xì)胞色素P450(P450)的特異性酶抑制劑—磷酸三苯酯(TPP)、順丁烯二酸二乙酯(DEM)和增效醚(PBO)對(duì)炔螨特的增效作用。三種特異性酶抑制劑對(duì)敏感品系朱砂葉螨雌成螨沒有增效作用，在抗性品系(F34)中，TPP和PBO對(duì)炔螨特的增效比分別為1.059和1.471，增效作用不明顯，而DEM的增效作用相對(duì)明顯

14、，增效比達(dá)2.583。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步運(yùn)用噴霧法(Potterspraymethod)測(cè)定兩個(gè)品系內(nèi)各個(gè)發(fā)育階段螨態(tài)中，DEM對(duì)炔螨特的增效作用，結(jié)果顯示DEM對(duì)敏感品系各螨態(tài)朱砂葉螨沒有增效作用，在抗性品系(F34)的卵、幼螨、若螨中，DEM對(duì)炔螨特的增效比分別為1.269、1.164、1.092，增效作用不明顯，而在成螨中的增效作用相對(duì)明顯，增效比達(dá)1.9916。根據(jù)酶特異性抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較兩個(gè)品系內(nèi)GSTs酶活性差異，當(dāng)?shù)孜?/p>

15、分別為GSH和CDNB時(shí)，朱砂葉螨抗性品系(F34)的GSTs比活力分別是敏感品系的1.982倍和2.719倍。綜上，酶特異性抑制劑和酶活性實(shí)驗(yàn)表明，GSTs在朱砂葉螨對(duì)炔螨特的解毒代謝中發(fā)揮了重要作用，可能與其抗性密切相關(guān)，且在朱砂葉螨不同品系和不同發(fā)育階段中的作用存在差異，這將在后一部分研究中在分子生物學(xué)水平探討。
　　3.朱砂葉螨GSTs基因的克隆及其mRNA的表達(dá)模式
　　3.1朱砂葉螨GSTs基因cDNA克隆及序列

16、分析
　　參考朱砂葉螨的近緣種二斑葉螨全基因組信息，利用RT-PCR技術(shù)，從朱砂葉螨體內(nèi)克隆獲得了12個(gè)GSTs基因cDNA序列，并比對(duì)確定了這12個(gè)GSTs基因的開放閱讀框，對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了推導(dǎo)。根據(jù)與其他物種的序列相似性和聚類分析結(jié)果，將其中的2個(gè)基因歸類于Delta家族，5個(gè)基因歸類于Mu家族，2個(gè)基因歸類于Omega家族，以及Kappa和Zeta家族基因各1個(gè)，余下的1個(gè)基因則不能劃分在已知的類型中，暫將其歸為未

17、分類家族Unclassified。2個(gè)Delta家族基因間的氨基酸同源性為88.58％，5個(gè)Mu家族基因間的氨基酸的同源性范圍介于41.26-98.67％，2個(gè)Omega家族基因的氨基酸同源性為45.38％，而在任意的非同一家族之間，氨基酸序列同源性在5.07-18.52％之間。根據(jù)命名法則命名這些GSTs基因并在GenBank上登錄，其名稱和登錄號(hào)分別為:TcGSTd1(KF421142)、TcGSTd2(KF421143)、TcGS

18、Tm1(KF421144)、TcGSTm2(KF421149)、TcGSTm3(KF421146)、TcGSTm4(KF421147)、TcGSTm5(KF421148)、TcGSTo1(KF421150)、TcGSTo2(KF421151)、TcGSTz1(KF421153)、TcGSTk1(KF421152)、TcGSTu2(KF421145)?？寺∷@得的12個(gè)GSTs基因編碼區(qū)長(zhǎng)度范圍是651-735bp，編碼216-244個(gè)氨

19、基酸，相對(duì)分子量為24.19-28.95kDa，理論等電點(diǎn)的范圍是5.97-8.99，TMHMM2.0跨膜預(yù)測(cè)顯示12個(gè)基因編碼的氨基酸序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，易于分離純化。ScanProsite推測(cè)氨基酸保守功能域表明，這些基因N-端結(jié)構(gòu)域高度保守，具有多個(gè)GSH的結(jié)合位點(diǎn)。將克隆獲得的朱砂葉螨各家族GSTs基因同黑腹果蠅、橘全爪螨、二斑葉螨等物種氨基酸序列進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示朱砂葉螨Delta家族的GSTs氨基酸序列相對(duì)保守，具有與

20、其他物種相同的催化活性中心絲氨酸S、天冬酰胺N以及決定蛋白折疊的氨基酸脯氨酸P、亮氨酸L、甘氨酸G、天冬氨酸D。朱砂葉螨Mu家族GSTs基因同樣相對(duì)保守，具有催化活性中心酪氨酸Y，以及決定蛋白折疊的蘇氨酸T、苯丙氨酸F以及AILRYLARKH特征基序。朱砂葉螨Omega家族GSTs的關(guān)鍵殘基半胱氨酸C代表GSH的催化位點(diǎn)，N-端結(jié)構(gòu)域非常保守，特征基序是ESLIIAEYL。
　　3.2朱砂葉螨RT-qPCR內(nèi)參基因篩選
　　

21、運(yùn)用geNorm和NormFinder軟件，對(duì)6個(gè)看家基因α-TUB、RPS18、EF1α、5.8SrRNA、SDHA、GAPDH在朱砂葉螨不同發(fā)育階段（卵、幼螨、若螨和雌成螨）和不同品系（敏感品系F0和炔螨特抗性品系F34）中的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果分析表明，在朱砂葉螨不同發(fā)育階段中，穩(wěn)定性較好的是RPS18和GADPH，在不同品系中，經(jīng)篩選表達(dá)最穩(wěn)定的是α-TUB和RPS18，綜合考慮評(píng)價(jià)結(jié)果，選用RPS18作為內(nèi)參基因用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

22、
　　3.3朱砂葉螨不同發(fā)育階段GSTs基因的表達(dá)模式
　　運(yùn)用定量PCR技術(shù)（quantitativereal-timePCR，qPCR），以朱砂葉螨RPS18作為內(nèi)參基因，對(duì)所克隆的8個(gè)GSTs基因在不同發(fā)育階段（卵、幼螨、若螨、雌成螨）mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了相對(duì)定量分析。
　　在朱砂葉螨敏感品系中，Delta家族的2個(gè)基因TcGSTd1和TcGSTd2在幼螨和若螨階段的相對(duì)卵期的表達(dá)量上調(diào)，在若螨期明顯高于卵期，

23、隨后在成螨階段下降。而在朱砂葉螨抗性品系中，這2個(gè)基因在幼螨、若螨和成螨階段隨著發(fā)育歷期的增加其相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，在成螨達(dá)到最高。朱砂葉螨敏感品系Mu家族5個(gè)GSTs基因中，TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm3、TcGSTm4在幼螨的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其余三個(gè)發(fā)育階段，隨后降低，最終在成螨期的表達(dá)量與卵期相當(dāng);TcGSTm5基因的相對(duì)表達(dá)量隨著發(fā)育階段的增加而逐漸升高，若螨階段表達(dá)量達(dá)到最高;TcGSTz1基因在4個(gè)螨態(tài)中的

24、相對(duì)表達(dá)量沒有較大波動(dòng)。在抗性品系中，TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm4隨著發(fā)育歷期的增加其表達(dá)量上調(diào)，在若螨期達(dá)到高峰，然后在成螨階段的相對(duì)表達(dá)量降低，但還是高于卵期的表達(dá)量;TcGSTm3在幼螨階段的表達(dá)量顯著增高，隨后在若螨階段突然下調(diào)后在成螨其恢復(fù)到與卵期相當(dāng)?shù)乃健cGSTm5基因的相對(duì)表達(dá)量隨著發(fā)育階段的增加而逐漸上調(diào);TcGSTz1基因在朱砂葉螨卵期、幼螨和成螨期的相對(duì)表達(dá)量略有上調(diào)，其顯著表達(dá)高峰出現(xiàn)在若螨

25、期。由上述基因在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)模式推測(cè)，TcGSTd1和TcGSTd2不僅參與了朱砂葉螨正常的生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)，而且在成螨階段在該螨對(duì)炔螨特的抗性中發(fā)揮了重要作用，Mu家族5個(gè)GSTs基因也不同程度地參與了朱砂葉螨對(duì)炔螨特的抗性。
　　3.4朱砂葉螨不同品系GSTs基因的表達(dá)模式
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，以朱砂葉螨RPS18作為內(nèi)參基因，對(duì)所克隆的8個(gè)GSTs基因在敏感品系和炔螨特抗性品系(F34)mRNA表達(dá)水

26、平進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果表明，相對(duì)于敏感品系，8個(gè)GSTs基因在朱砂葉螨抗性品系中總體趨勢(shì)表現(xiàn)為卵期和幼螨期表達(dá)下調(diào)，而若螨和成螨期顯著上調(diào)。在卵期，朱砂葉螨抗炔螨特品系的TcGSTd2基因的相對(duì)表達(dá)顯著下降，推測(cè)該基因參與了螨類在這一階段的生理活動(dòng)。在幼螨期，朱砂葉螨抗炔螨特品系Delta家族的2個(gè)GSTs基因TcGSTd1和Mu家族的4個(gè)GSTs基因TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm4基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，推測(cè)這幾個(gè)基因

27、在這一螨態(tài)發(fā)揮了重要生理功能。在若螨和成螨期，8個(gè)GSTs基因的相對(duì)表達(dá)量都上調(diào)，其中TcGSTd1、TcGSTd2、TcGSTm1、TcGSTm2、TcGSTm4和TcGSTm5顯著增加，表明這些基因參與了該螨的生理功能和抗藥性的形成。
　　3.5朱砂葉螨GSTs基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建
　　利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ的雙酶切以及DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了朱砂葉螨TcGSTm2基因基于pET30a(+)的原核表達(dá)載體，

28、為進(jìn)一步深入研究GSTm蛋白質(zhì)特性和功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究開展了對(duì)云南桑園朱砂葉螨不同田間種群的抗藥性測(cè)定，在室內(nèi)繼代選育朱砂葉螨炔螨特抗性種群，獲得抗性倍數(shù)達(dá)30.669的相對(duì)抗性品系，以該品系和敏感品系為基礎(chǔ)，研究了朱砂葉螨對(duì)炔螨特的抗性發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)其抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力和抗性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，在對(duì)抗性品系酶特異性抑制實(shí)驗(yàn)和生理生化特性分析基礎(chǔ)上，確定了朱砂葉螨體內(nèi)重要解毒代謝酶系GSTs是作為炔螨特抗性機(jī)制的主導(dǎo)因

29、子，以此為基礎(chǔ)，在分子水平上進(jìn)一步解析GSTs基因在朱砂葉螨對(duì)炔螨特的抗性分子機(jī)制中的作用。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆了12個(gè)朱砂葉螨GSTs基因，分析了這些基因的分子生物學(xué)特性。并采用geNorm和NormFinder軟件確定了朱砂葉螨不同發(fā)育階段和不同品系的最適內(nèi)參基因。采用qPCR技術(shù)，解析了本研究所克隆的8個(gè)GSTs基因在朱砂葉螨敏感品系和炔螨特抗性品系mRNA水平表達(dá)模式和差異，揭示了這些基因在朱砂葉螨抗性過程中發(fā)揮的作用。成功