菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)在硫丹脅迫下毒性效應(yīng)與分子生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、硫丹（Endosulfan）作為一種持久性有機氯化合物，已經(jīng)被世界上很多環(huán)境保護組織列為劇毒物之一。本研究選擇重要經(jīng)濟貝類菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum）作為研究對象，分別從酶學(xué)水平和分子水平研究了硫丹對菲律賓蛤仔的急性毒性和亞慢性毒性效應(yīng)，構(gòu)建了硫丹脅迫下的菲律賓蛤仔的cDNA消減文庫，篩選、鑒定了差異表達基因，為硫丹的毒性效應(yīng)研究尤其是對水生無脊椎動物的毒性研究提供參考，為海洋環(huán)境中硫丹污染的生物監(jiān)測提供

2、依據(jù)，豐富了海洋雙殼貝類的基因庫；同時，對于保障貝類健康養(yǎng)殖和海產(chǎn)品食品安全也具有重要的現(xiàn)實意義。
　　1.硫丹對菲律賓蛤仔毒性效應(yīng)的研究
　　本文研究了硫丹對菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum）的毒性作用，實驗選取菲律賓蛤仔幼貝、成貝殼高分別為(1.0±0.15) cm、（4.6±0.2）cm。設(shè)置一系列濃度梯度：0.1、1、10、100μg/L，在實驗時間內(nèi)各處理組同一染毒時間隨著染毒濃度的增加或

3、染毒時間的延長，菲律賓蛤仔成貝和幼貝存活狀況良好，均無死亡。硫丹處理濃度隨后增加到硫丹最大溶解度（0.99mg/L）進行同樣實驗，菲律賓蛤仔成貝和幼貝仍無死亡，硫丹對菲律賓蛤仔未產(chǎn)生明顯的急性毒性效應(yīng)。
　　另外，設(shè)置0.005、0.05和0.5μg/L的硫丹染毒濃度對菲律賓蛤仔的亞慢性毒性進行研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度硫丹（0.005、0.05和0.5μg/L）對菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊組織解毒代謝酶酶活性、抗氧化指標(biāo)和DNA損傷水平均

4、發(fā)生顯著影響，且具有明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系，對照組無明顯變化。在0.05μg/L和0.5μg/L硫丹處理組暴露1d后，菲律賓蛤仔消化盲囊組織中EROD活力即出現(xiàn)明顯增加且與對照組相比差異顯著（P<0.05或P<0.01），并且隨著染毒時間的延長，EROD活力持續(xù)增加，然而鰓組織中EROD活力變化與對照組相比差異不顯著；兩組織GST活力、GSH含量和LPO水平在各硫丹處理組均被顯著誘導(dǎo)（P<0.05），且在一定染毒時間內(nèi)呈峰值變化；與對

5、照組相比，兩組織中 SOD活力在低濃度處理組首先被誘導(dǎo)，隨后降低并逐漸恢復(fù)至對照組水平（P＞0.05），但在0.05μg/L和0.5μg/L處理組均被顯著抑制，且在一定染毒時間內(nèi)呈峰值變化；兩組織中0.005μg/L硫丹處理組F值（DNA損傷水平）在3d內(nèi)呈峰值變化，于3d達到最小值，并于3d后逐漸恢復(fù)至對照組水平（P＞0.05），在0.05μg/L和0.5μg/L處理組，兩組織的F值在染毒1d時就顯著減?。≒<0.05），隨著染毒時間

6、的延長慢慢升高，但仍顯著低于對照組水平（P<0.05），鰓絲和消化盲囊組織中 F值表現(xiàn)出相似的變化趨勢。由此可見，硫丹對菲律賓蛤仔雖沒有明顯的急性毒性作用，但組織解毒代謝酶活力、抗氧化指標(biāo)變化和DNA損傷水平與硫丹濃度表現(xiàn)出明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系，而且相關(guān)性分析可知，菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊組織GST活力、SOD活力、LPO水平以及DNA損傷水平與硫丹染毒濃度呈線性相關(guān)性，可作為硫丹海洋污染監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。
　　2.菲律賓

7、蛤仔在硫丹脅迫下差異基因的篩選與表達分析
　　本研究采用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）分別成功構(gòu)建了1 d和10 d硫丹脅迫下（0.5μg/L）菲律賓蛤仔正、反向 cDNA消減文庫，測序分析結(jié)果顯示，1d正、反向消減文庫中分別含有56種和50種Unigene與GenBank中的己知功能序列具有較高的同源性（E<0.1）；10d正、反向cDNA文庫中分別有40種和72種 Unigene與 GenBank中的己知功能序列具有較高的同源性

8、（E<0.1）。對EST序列進行功能注釋分類結(jié)果表明，這些差異表達基因主要與以下功能相關(guān)：轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、外源物質(zhì)解毒、機體免疫、機體代謝等，還有一些其它未分類基因。ESTs序列信息均已提交至 Genbank數(shù)據(jù)庫，cDNA消減文庫編號為 LIBEST_027859，部分基因的GenBank序列號為JK845831-JK845901。對差異表達基因在不同濃度硫丹（0.05和0.5μg/L）脅迫下的熒光定量實驗結(jié)果