基于PCR放大效應(yīng)的超靈敏分子生物標(biāo)志物檢測方法研究.pdf

1、PCR技術(shù)具有超高的靈敏性和強(qiáng)大的擴(kuò)增放大效應(yīng),可把痕量核酸甚至僅幾個分子在幾小時內(nèi)數(shù)百萬倍擴(kuò)增富集,從而使不易檢測的物質(zhì)方便檢測,使可以檢測的物質(zhì)達(dá)到痕量檢測.該研究利用PCR技術(shù)指數(shù)級擴(kuò)增的特性,結(jié)合核酸酶保護(hù)分析技術(shù),進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測和miRNAs的檢測,大大提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度,降低了miRNAs檢測的難度,初步建立了兩種分子生物標(biāo)志物靈敏、易行、價廉的檢測方法.該研究分兩部分:1基于aptamer和核酸外切酶保護(hù)分析技術(shù)的

2、超靈敏蛋白質(zhì)檢測方法設(shè)計策略:Aptamer是通過體外篩選技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸庫中篩選出的一段寡核苷酸序列,它對相應(yīng)的靶分子有很高特異性和很高親合力.核酸外切酶I(ExoI)催化3'末端羥基的單鏈寡核苷酸從3'端向5'端降解,產(chǎn)生5'單磷酸脫氧核苷和末端二磷酸二核苷.以凝血酶aptamer為例,利用aptamer和ExoI的特性,以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ),我們建立了一種凝血酶高靈敏的檢測方法稱作外切酶保護(hù)分析(Exonuclease Prote

3、ctionAssay,EPA).EPA-PCR凝血酶檢測:將特定濃度的凝血酶稀釋為四個濃度梯度系列,相鄰濃度相隔2個數(shù)量級,外切酶保護(hù)分析處理,連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增.同時將與連接產(chǎn)物序列一致的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成四個濃度梯度10<'-15>~10<'-9>M,相鄰濃度相隔兩個數(shù)量級,進(jìn)行PCR擴(kuò)增.EPA一實時PCR凝血酶定量檢測:將標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列(10<'-15>~10<'-9>M)和凝血酶濃度系列(2.75×10<'-13>~2.75×10<

4、'-5>M)連接產(chǎn)物進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR,檢測.2 microRNAs的檢測利用miRNAs長20~25nt、單鏈、3'羥基、5'磷酸的特點我們設(shè)計了一段與miR-122a序列有關(guān)的59nt寡核苷酸片段和兩端的linkers.然后檢測肝臟、心臟和腦組織中miR-122a的含量.該試驗利用液相雜交技術(shù)和核酸酶保護(hù)分析原理,創(chuàng)建了一種簡單、價廉、靈敏度高的miRNAs的檢測方法,有望成為又一種檢測miRNAs的方法.各