家兔促卵泡激素β(FSHβ)基因克隆及表達研究.pdf

1、促卵泡激素是由動物垂體前葉嗜堿性細胞合成并分泌的一種糖蛋白激素，由α和β亞基組成，而β亞基是激素生物活性和免疫活性的決定因素。促卵泡激素β亞單位由FSHβ基因編碼，前人的研究表明，F(xiàn)SHβ基因多態(tài)性與動物多產(chǎn)性有密切關(guān)聯(lián)性，該基因是影響動物產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一。本研究以新西蘭白兔為研究對象，采用基因克隆、原核表達和Real-time PCR等方法研究家兔FSHβ基因的在原核表達系統(tǒng)中的表達情況，制備抗家兔FSHβ多克隆抗體，并對FSHβ

2、基因在家兔卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達差異進行了分析。主要結(jié)果如下:
　　1.本研究參考GenBank數(shù)據(jù)庫中日本大耳兔FSHβ基因的mRNA序列設(shè)計了一對引物，對新西蘭白兔FSHβ基因進行克隆、序列分析，并將其與其它物種的FSHβ基因CDS序列和編碼氨基酸序列進行同源性比較。結(jié)果表明，克隆得到的CDS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致，核苷酸序列與其它哺乳動物的同源性較高(86.4％～89.7％)，

3、但與禽類、魚類的同源性較低，分別為74.1％和53.3％。基于FSHβ基因序列進行系統(tǒng)進化分析，可知家兔與人、黑猩猩的親緣關(guān)系較近，聚類分析結(jié)果與生物學(xué)分類結(jié)果基本一致。
　　2.PCR擴增FSHβ基因去信號肽序列，并成功構(gòu)建了去信號肽FSHβ基因的原核表達載體pGEX-4T-1-FSHβ，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、超聲波破碎菌體、SDS-PAGE凝膠電泳檢測，得到大小約為42kDa的融合蛋白，而且重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3

4、)中的表達產(chǎn)物主要是以包涵體形式存在的，將得到的包涵體融合蛋白純化后免疫小鼠，分離小鼠血清，得到FSHβ多克隆抗體，對多克隆抗體進行ELISA和Western Blot檢測，結(jié)果表明抗體的效價為1∶256000，特異性較好。
　　3.對FSHβ基因在9～23周齡家兔的卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達水平進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，F(xiàn)SHβ基因在5個生殖器官中均有表達，13周齡各組織間表達量差異不顯著(P