牛蛙生長激素基因克隆及其表達效應研究.pdf

1、四川大學博士學位論文牛蛙生長激素基因克隆及其表達效應研究姓名：龍章富申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：劉世貴20030430叫川人學博I學位論文Takahashi等(1992)報道的牛蛙GH蛋白序列(AAB24792)的同源性為97％，與Kobalyashi等(1991)報道的牛蛙GH蛋白序歹mJ(AABl9428)的同源性為95％。本研究克隆的牛蛙生長激素基因BfGH已在GenBank登記(AY251538)。采用雙酶切牛蛙GH

2、基因cDNA片斷和原核表達載體pGEXl一九T，將BfGHcDNA定向插入到pGEXlXT，經酶切鑒定后進行IPTG誘導表達研究。表達研究結果包括三方面，一是重組pGBfGH在大腸桿菌中表達的融合蛋白分子量為509KDa，符合推導分析的預期大小；二是誘導條件的優(yōu)化，在添加ImM／LIPTG誘導表達3hrs就能得到高效表達，經定量分析，牛蛙生長激素基因在大腸桿菌中的表達量可達到菌體總蛋白的293％；通過比較不同誘導時問和不同濃度的誘導劑用

3、量等研究，結果表明在IPTG濃度為0ImM／L時，37℃誘導表達4hrs，其表達量與1mM／L濃度的IPTG，37℃誘導表達3hrs的表達量一致，這為大量表達生產重組牛蛙GH蛋白時降低IPTG用量、從而降低生產成本提供了理論依據。三是重組BfGH在大腸桿菌中的表達以形成包涵體的形式存在。通過回收原核表達的牛蛙GH重組蛋白(reBfGH)，并制各抗B好H的兔抗高免血清，采用牛蛙肝受體膜蛋白為吸附受體，以回收的重組牛蛙生長激素融合蛋白為抗原

4、，兔抗BfGH高免血清為一抗，辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG(HRP—IgG)為二抗，進行ELISA—RA檢測，驗證了回收的重組牛蛙生長激素融合蛋白具有較強的生物活性和免疫活性。以VRl020為載體，構建了牛蛙GH真核表達質粒VBfGH、草魚GH真核表達質粒VgcGH，并以脂質體為載體進行了Cos7細胞轉染表達實驗。在轉染2472hrs后，對抽提的轉染細胞總RNA進行RTPCR檢測發(fā)現，轉染24hrsVBfGH在Cos7細胞中即有轉錄，并

5、在72hrs時轉錄量最強；以轉染細胞培養(yǎng)液為抗原進行ELISARA檢測。轉染24hrs、48hrs、72hrs的牛蛙生長激素表達量分別為2540ng／ml，5867ng／ml和7347ng／r01。為進一步驗證牛蛙重組生長激素蛋白和真核表達質粒轉染表達對牛蛙的生物活性，進行脂質體包裹重組reBfGH蛋白、脂質體包裹VBfGH質粒、脂質體包裹草魚GH真核表達質粒VgcGH、脂質體包裹VRl020質粒對牛蛙體內促長效果的比較研究，并以脂質體