花生中脅迫抗性microRNA的挖掘鑒定和功能分析.pdf

1、MicroRNA，又稱miRNA，是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒等多種生物體內(nèi)、大小為21-25nt左右的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[1]。MicroRNAs以堿基互補(bǔ)對(duì)的方式對(duì)靶基因進(jìn)行翻譯抑制或降解，在多細(xì)胞生物的基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)miRNA的鑒定和功能分析已經(jīng)成為了研究的熱點(diǎn)并在過去的十年研究中取得了巨大成果。
　　花生是世界四大油料作物之一，同時(shí)也是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的一類十分重要的經(jīng)濟(jì)作物?；ㄉ?/p>

2、為我國主要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物，其分子生物學(xué)遺傳育種研究一直受到廣泛的重視，目前鮮見花生內(nèi)源性miRNA的功能與抗性相結(jié)合的研究。
　　本論文利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，通過設(shè)置篩選的條件，新發(fā)現(xiàn)60條保守花生miRNA序列。根據(jù)植物miRNAs序列在物種間的高度保守性及其前體獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，通過在miRNAs數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，最終將60條miRNA序列歸屬分類于16個(gè)家族中。然后，利用Target-align軟件

3、和BLASTx分析對(duì)60花生miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，除2條miRNA序列未發(fā)現(xiàn)靶基因外，其他58條miRNA序列共計(jì)預(yù)測(cè)獲得392條靶基因序列，經(jīng)過對(duì)靶基因的GO功能分析發(fā)現(xiàn)，miRNA的靶基因介導(dǎo)參與花生生長發(fā)育，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及脅迫抗性等多個(gè)生物學(xué)過程和功能。
　　生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNAs具有方便、快速和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但是在預(yù)測(cè)過程中會(huì)存在假陽性序列，需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，來完善和驗(yàn)證預(yù)測(cè)。通過poly(A)加尾實(shí)驗(yàn)方

4、法，經(jīng)過對(duì)反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，最終16個(gè)家族的60條miRNAs中55條miRNA序列得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功率高達(dá)為91.67％。miR159家族，miR319家族，miR394家族中各有1條miRNA序列未被檢出，miR482家族中有兩條miRNA序列未被檢出。
　　miRNA靶基因的確認(rèn)工作是研究miRNA功能中最關(guān)鍵的一步。植物miRNA序列通常以一種完美互補(bǔ)或近乎完美互補(bǔ)的匹配方式切割靶基因，進(jìn)而造成靶基因序列的降解?；谶@一

5、點(diǎn)本研究使用5'-RACE的方法對(duì)預(yù)測(cè)的花生靶基因切割位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)隨即選擇20條花生靶基因序列作為驗(yàn)證對(duì)象，通過凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和克隆測(cè)序結(jié)果可知，其中14條(70％)花生miRNA-靶基因獲得驗(yàn)證，大部分miRNAs作用于靶基因的切割位點(diǎn)位于第9-11個(gè)核苷酸位點(diǎn)處，并且部分靶基因存在多個(gè)切割位點(diǎn)的情況。
　　本研究對(duì)靶基因序列進(jìn)行功能分析和同源序列功能檢索，初步選擇26條靶基因序列作為脅

6、迫研究對(duì)象，并在黃曲霉侵染和干旱脅迫條件下，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定相關(guān)抗性miRNA及其靶基因的表達(dá)水平。針對(duì)miRNA負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)水平模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，共有5組miRNA靶基因符合要求，初步確定部分與脅迫抗性相關(guān)的miRNA及其靶基因的生物學(xué)功能。
　　通過生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的手段，完成花生中與脅迫抗性相關(guān)的miRNAs的挖掘，預(yù)測(cè)其靶基因并篩選鑒定miRNAs的功能。通過增強(qiáng)或削弱內(nèi)源性miRNA的基因沉