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文檔簡介
1、研究背景及存在的科學(xué)問題:
昆蟲的生長和變態(tài)主要由蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(juvenilehormone,JH)調(diào)控。在幼蟲生長期高滴度JH存在的條件下,20E滴度增加調(diào)控幼蟲不同齡期間的蛻皮。在末齡幼蟲轉(zhuǎn)變?yōu)槌上x的變態(tài)期,JH滴度下降或消失,20E起始變態(tài)。20E的主要功能是促進(jìn)蛻皮與變態(tài),而JH主要維持幼蟲狀態(tài)。二者在體內(nèi)的滴度比例交互變化,功能既拮抗又統(tǒng)一,協(xié)同調(diào)控昆蟲發(fā)育。由
2、于20E是小分子脂溶性激素,早期研究認(rèn)為20E通過滲透進(jìn)入細(xì)胞膜,與胞內(nèi)受體ecdysonereceptor(EcR)結(jié)合,在熱休克蛋白幫助下與超氣門蛋白u(yù)ltraspiracle(USP)形成EcR-USP轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,結(jié)合在DNA啟動(dòng)子上,啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄,實(shí)現(xiàn)蛻皮與變態(tài),即20E基因組途徑。目前已有一些研究報(bào)道20E能夠通過細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)引起Ca2+信號(hào)增強(qiáng),蛋白快速移位和磷酸化,環(huán)腺苷酸水平升高等細(xì)胞快速應(yīng)
3、答反應(yīng),這暗示20E存在非基因組途徑。JH也是小分子脂類激素,研究認(rèn)為JH也是通過滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),結(jié)合胞內(nèi)受體methoprene-tolerant(Met)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。
20E和JH通過調(diào)控不同的基因轉(zhuǎn)錄控制昆蟲的生長和變態(tài)。研究報(bào)道絕緣小體蛋白modifierofmdg4[mod(mdg4)]通過與轉(zhuǎn)錄因子SuppressorofHairy-wing[Su(Hw)]形成絕緣小體來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡。變態(tài)期昆蟲的中腸在
4、20E調(diào)控下發(fā)生程序性細(xì)胞死亡(PCD),mod(mdg4)是否參與調(diào)控昆蟲變態(tài)期組織PCD相關(guān)基因表達(dá)還沒有報(bào)道。GPCRs是最大的膜蛋白家族,它們參與調(diào)控激素、神經(jīng)遞質(zhì)等激活的細(xì)胞生理反應(yīng)。在果蠅中發(fā)現(xiàn)多巴胺GPCR受體可以結(jié)合蛻皮激素,家蠶絲腺中GPCR參與了蛻皮激素調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡,但蛻皮激素的GPCR受體及介導(dǎo)的信號(hào)途徑少有報(bào)道。Broad(Br)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,20E調(diào)控Br高表達(dá)起始變態(tài)。在幼蟲生長期,JH通過抑
5、制Br表達(dá)來抑制20E途徑,但給幼蟲注射JH卻能夠上調(diào)Br表達(dá)并抑制變態(tài)過程,JH調(diào)控Br表達(dá)的分子機(jī)制尚未闡明。另外Br蛋白本身的穩(wěn)定性問題也研究甚少。本論文選擇mod(mdg4)、GPCRs和Br作為靶標(biāo)基因,研究蛻皮激素的非基因組途徑及保幼激素抑制變態(tài)的分子機(jī)理,豐富激素調(diào)控昆蟲發(fā)育的理論知識(shí),為害蟲控治提供靶標(biāo)基因。
研究結(jié)果與結(jié)論:
1.mod(mdg4)1A蛋白參與激素調(diào)控的中腸程序性細(xì)胞死亡
6、Mod(mdg4)1A在變態(tài)期的表皮、中腸和脂肪體中高表達(dá),并定位于變態(tài)期幼蟲中腸。當(dāng)mod(mdg4)1A被干擾后,幼蟲變態(tài)過程被延遲,中腸PCD被抑制,促進(jìn)PCD和變態(tài)發(fā)生的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄被顯著抑制。20E并不通過經(jīng)典的EcRB1-USP1基因組途徑上調(diào)mod(mdg4)1a表達(dá),而Methoprene可以通過JH核受體Met1上調(diào)mod(mdg4)1a表達(dá)。20E和methoprene可以分別上調(diào)mod(mdg4)1a表達(dá),但疊加
7、卻抑制mod(mdg4)1a表達(dá)。結(jié)論:mod(mdg4)1A在20E和JH調(diào)控下通過調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄水平參與中腸PCD和變態(tài)。
2.G蛋白偶聯(lián)受體ErGPCR在細(xì)胞膜上參與蛻皮激素介導(dǎo)的信號(hào)途徑
ErGPCR在幼蟲的蛻皮期和變態(tài)期高表達(dá)。當(dāng)蟲體注射dsErGPCR后,幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)變和20E應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄均被抑制,而細(xì)胞系過表達(dá)ErGPCR增強(qiáng)20E應(yīng)答基因表達(dá)。沉默ErGPCR能夠抑制胞內(nèi)Ca2+濃度增加并抑制2
8、0E誘導(dǎo)的Calponin快速入核和磷酸化。T型電壓門控鈣離子通道抑制劑和經(jīng)典瞬時(shí)受體電壓鈣離子通道抑制劑能夠抑制20E誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高,并抑制基因表達(dá)和蛋白質(zhì)磷酸化。N末端缺失的ErGPCR突變體定位于細(xì)胞質(zhì)并不能增強(qiáng)20E相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。ErGPCR不能與20E類似物[3H]IPonA結(jié)合。20E可以通過ErGPCR調(diào)控EcRB1-USP1基因組途徑,也可以通過ErGPCR而不通過EcRB1-USP1調(diào)控mod(mdg4)1
9、A表達(dá)。結(jié)論:20E通過ErGPCR調(diào)控Calponin快速入核和磷酸化,誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,調(diào)控20E應(yīng)答基因表達(dá)并參與幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)變過程。
3.JH通過調(diào)控新型BroadⅡ磷酸化抑制變態(tài)
本研究從棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)一種新型Br蛋白BroadⅡ(BrZ-Ⅱ)。蟲體干擾BrZ-Ⅱ后,幼蟲的變態(tài)過程和20E應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄均被顯著抑制。在幼蟲生長時(shí)期,BrZ-Ⅱ表達(dá)量比較低并處于磷酸化狀態(tài);而在變態(tài)時(shí)期,BrZ-Ⅱ保持高
10、表達(dá)的非磷酸化狀態(tài)。G蛋白偶聯(lián)受體,磷脂酶C,和蛋白激酶C抑制劑均能抑制JH誘導(dǎo)的BrZ-Ⅱ磷酸化。JH誘導(dǎo)的磷酸化的BrZ-Ⅱ能夠與Calponin非編碼區(qū)的Br結(jié)合元件結(jié)合。蟲體注射JHⅢ誘導(dǎo)BrZ-Ⅱ磷酸化,抑制20E相關(guān)基因表達(dá)并阻止變態(tài)。JH誘導(dǎo)非磷酸化的Calponin與超氣門蛋白USP1結(jié)合激活JH途徑并抑制20E途徑。結(jié)論:體內(nèi)JH調(diào)控BrZ-Ⅱ磷酸化來介導(dǎo)JH應(yīng)答基因表達(dá)指導(dǎo)幼蟲生長;20E調(diào)控BrZ-Ⅱ高表達(dá)和非磷酸
11、狀態(tài)參與變態(tài)。外源JH誘導(dǎo)BrZ-Ⅱ高表達(dá)及磷酸化直接調(diào)控Calponin高表達(dá),非磷酸化的Calponin與USP1結(jié)合激活JH途徑從而抑制20E信號(hào)途徑并抑制變態(tài)過程。
4.熱休克蛋白90結(jié)合BroadⅡ的BTB結(jié)構(gòu)域保持其穩(wěn)定性和功能
在體內(nèi)和體外Hsp90均能結(jié)合BrZ-Ⅱ,Hsp90通過中間結(jié)構(gòu)域與BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Hsp90抑制劑17-allylamino-17-desmethoxygelda
12、namycin(17-AAG)能夠抑制Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合,導(dǎo)致BrZ-Ⅱ蛋白水平降低但不影響B(tài)rZ-Ⅱ的mRNA水平。蛋白酶體抑制劑MG-132能夠抑制17-AAG誘導(dǎo)的BrZ-Ⅱ降解。BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構(gòu)域缺失或17-AAG預(yù)處理能夠抑制Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合,并抑制BrZ-Ⅱ在20E和JH信號(hào)途徑中的基因調(diào)控功能。結(jié)論:Hsp90通過中間結(jié)構(gòu)域與BrZ-Ⅱ的BTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Hsp90與BrZ-Ⅱ的結(jié)合對(duì)于BrZ-
13、Ⅱ的穩(wěn)定性及其在20E和JH信號(hào)途徑中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能是必需的。
研究成果及科學(xué)意義:
mod(mdg4)1A的研究結(jié)果一方面深入闡明了20E和JH相互作用調(diào)控昆蟲中腸PCD的分子機(jī)制,另一方面揭示了20E存在除EcR/USP經(jīng)典基因組途徑之外的信號(hào)途徑。有關(guān)ErGPCR的研究結(jié)果為20E非基因組途徑提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),將非基因組途徑與基因組途徑聯(lián)系起來,并證明20E存在多種信號(hào)途徑。JH誘導(dǎo)一種新型Br蛋白BrZ-Ⅱ
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