油菜種子貯藏物質(zhì)合成及外源激素調(diào)控的生化分析.pdf

1、油菜作為我國重要的油料作物，是食用油和飼料蛋白的重要來源，怎樣提高油菜籽產(chǎn)量及含油量一直都是油菜育種的研究重點。盡管植物貯藏物質(zhì)合成的主要途徑已經(jīng)被研究得比較清楚，但是該途徑受到外界環(huán)境和內(nèi)部因素調(diào)控的分子機理不太明晰，因此從基因表達調(diào)控的角度來探索植物貯藏物質(zhì)合成途徑的調(diào)控機制的研究就顯得很有必要。本論文分析了43個擬南芥貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的啟動子序列，檢測了油菜的主要種子轉(zhuǎn)錄因子和貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達特性，研究了外源赤霉素（

2、GA）和脫落酸（ABA）對油菜籽貯藏物質(zhì)積累的影響及其相關(guān)基因表達的影響，篩選到了可能響應(yīng)脫落酸或赤霉素并調(diào)控貯藏物質(zhì)合成的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。論文的具體研究結(jié)果如下：
　?。?）系統(tǒng)分析了35個油脂合成關(guān)鍵酶基因和8個貯藏蛋白的編碼基因的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)共有246種順式元件出現(xiàn)在上述序列中，其中出現(xiàn)頻率大于70％的順式元件共有67種。其中，與脫落酸、赤霉素等植物激素信號途徑相關(guān)的順式元件有15種，與脅迫相關(guān)的有14種，與光調(diào)節(jié)相關(guān)

3、的順式元件有12種，與糖代謝相關(guān)的順式元件5種。以上分析結(jié)果暗示，植物油脂及貯藏蛋白的合成除受環(huán)境因素的影響外，還受到了植物內(nèi)源激素的調(diào)控。
　?。?）采用半定量RT-PCR分析了20個貯藏物質(zhì)相關(guān)基因和6個主要種子轉(zhuǎn)錄因子基因在甘藍型油菜不同組織器官中的表達情況，發(fā)現(xiàn)在果莢中有大量表達的貯藏物質(zhì)相關(guān)基因（16/20）最多，在葉片、花蕾和花朵中有表達的次之（12/20），在莖和根中有表達較少（3/20）。而6個主要種子轉(zhuǎn)錄因子基因

4、都集中在果莢中大量表達。隨后，采用熒光實時定量PCR（Q-PCR）進一步分析了上述基因在果莢各發(fā)育時期的表達量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子LEC1、LEC2和WRI以及多數(shù)的貯藏物質(zhì)相關(guān)基因（15/20）的表達量呈現(xiàn)先升高，隨后下降，至25 DAF（Days After Flowering）達到的最低，然后再升高的模式；轉(zhuǎn)錄因子FUS3、ABI3和ABI5的表達量則隨油菜果莢發(fā)育而持續(xù)增加到后期；貯藏蛋白基因Napin和Cruciferin在20 D

5、AF時才有明顯表達，之后分別在25 DAF和30 DAF出現(xiàn)表達高峰。同時，檢測了不同成熟時期油菜籽的總蛋白和粗脂肪含量，發(fā)現(xiàn)蛋白與油脂都隨著種子的成熟而持續(xù)增加，但二者在25DAF后的增加速度發(fā)生了對調(diào)。以上結(jié)果表明，25DAF是油菜籽發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，其可能的原因是由于主要種子轉(zhuǎn)錄因子在25DAF前后的表達變化引起了貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達變化，從而導(dǎo)致了油菜籽總蛋白和粗脂肪含量變化。
　?。?）采用100 mM赤霉素G

6、A3在油菜籽成熟前（15 DAF）、中（25 DAF）、后（35 DAF）期分別處理甘藍型油菜W6的果莢，發(fā)現(xiàn)3個時期的處理均能增加油菜籽的總糖含量和硫苷含量，而對油菜籽的含油量影響不明顯。同時發(fā)現(xiàn)，前期和中期GA3處理都能降低總蛋白含量，但后期處理則提高其含量，而油菜籽重量基本不受前期GA3處理的影響，卻在中期和后期GA3處理后降低。另外，通過對油脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測發(fā)現(xiàn)，油脂合成限速酶基因DGAT的表達量在前期處理中增加了1

7、倍以上，而在中期和后期處理中則沒有明顯變化，該結(jié)果與油菜籽含油量的變化一致。以上結(jié)果說明，在油菜籽成熟期間施用赤霉素對油菜籽產(chǎn)量、品質(zhì)及含油量都可能會造成不利影響。
　　（4）采用10μM的脫落酸在油菜籽成熟的前、中、后期分別處理甘藍型油菜W6和湘雜油3號的果莢，發(fā)現(xiàn)3個時期的處理都能夠增加油菜籽的重量和含油量，降低菜籽油中超長鏈脂肪酸含量。而對油菜籽的粗蛋白、總糖及硫苷含量的影響則兩個品種中存在不同。另外，通過對油脂合成相關(guān)基因

8、轉(zhuǎn)錄水平的檢測發(fā)現(xiàn)，脫落酸處理能夠長期地（5天或更長）促進基因DGAT的表達量增加，其表達量變化與油菜籽含油量變化一致。該研究結(jié)果表明，在油菜籽成熟期間進行脫落酸處理不但能顯著增加油菜籽產(chǎn)量及含油量還能改善菜籽油的品質(zhì)，對實際生產(chǎn)具有相當重要的指導(dǎo)意義。
　?。?）通過基因芯片數(shù)據(jù)分析和Q-PCR鑒定，篩選得到了在種子中大量表達并可能響應(yīng)脫落酸或赤霉素的3個功能未知的BnbZIP基因，并分別將其過量表達于擬南芥中。隨后對轉(zhuǎn)基因擬南

9、芥的表型分析發(fā)現(xiàn)，BnbZIP12過量表達株系的生長受到抑制，BnbZIP43過量表達株系的結(jié)實率顯著降低，而BnbZIP66過量表達株系的種子重量增加且貯藏物質(zhì)比例改變明顯。據(jù)此我們推測bZIP12參與了植物營養(yǎng)生長的調(diào)控，bZIP43參與了配子產(chǎn)生或受精過程的調(diào)控，bZIP66則參與了種子貯藏物質(zhì)合成的調(diào)控。
　　綜上所述，本研究為油菜的育種研究和實際生產(chǎn)提供了有益參考，也為探索種子貯藏物質(zhì)合成表達調(diào)控的分子機理與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子