香水檸檬無籽成因和相關(guān)基因的分離與鑒定.pdf

1、香水檸檬(Citrus limon(L.)Burm.F.)屬蕓香科柑橘屬常綠小喬木,果實長圓形,無核,成熟后香氣濃郁,一年四季都能開花結(jié)果,是優(yōu)良的栽培品種之一。本研究首先確定香水檸檬與其它檸檬品種間的親緣關(guān)系,并根據(jù)檸檬基因組特點設(shè)計SSR分子標(biāo)記引物。主要開展香水檸檬無籽機制的相關(guān)研究,從香水檸檬雌雄配子體育性、胚胎發(fā)育、授粉親和性調(diào)查其無籽的原因,在此基礎(chǔ)上通過轉(zhuǎn)錄組測序分析并篩選與無籽相關(guān)的候選基因,克隆其中3個基因的全長序列,

2、進行生物信息學(xué)分析,采用熒光定量方法分析基因的表達模式,構(gòu)建植物過量表達載體將這幾個基因轉(zhuǎn)入煙草,獲得轉(zhuǎn)基因植株為基因功能分析奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、采用ISSR和SCoT分子標(biāo)記對檸檬、萊檬和藜檬共39份資源進行了遺傳多樣性分析。兩種標(biāo)記擴增條帶的多態(tài)性相似,聚類分析顯示ISSR分子標(biāo)記和SCoT分子標(biāo)記都可以將39份資源大致分為檸檬、萊檬和藜檬三個類群,所有廣西來源的藜檬種質(zhì)劃分為一組,引進的檸檬種質(zhì)劃分為一組,

3、北京檸檬單獨歸為一組。在SCoT分子標(biāo)記中塔希提萊檬與歐美等引進檸檬品種聚在一起,但在ISSR標(biāo)記中與小萊檬聚在一起,SCoT分子標(biāo)記可以將里斯本、尤力克、費米耐勞和菲諾區(qū)分開,兩種分子標(biāo)記結(jié)果均顯示香水檸檬與白花檸檬親緣關(guān)系最近。
　　2、采用改良卡寶品紅染色壓片法觀察香水檸檬小孢子母細胞減數(shù)分裂,未見染色體橋、落后染色體等異?，F(xiàn)象,可以形成正常的四分體,胞質(zhì)分裂為同時型,成熟的花粉為2–核花粉粒。香水檸檬和白花檸檬均為二倍體,

4、花粉粒形態(tài)均為球形,平均每花藥的花粉數(shù)量相似,兩個品種花粉的生活力和萌發(fā)率,無顯著差異。
　　3、通過石蠟切片技術(shù)觀察雌配子體發(fā)育,胚囊母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成直線排列的四分孢子,其中1個發(fā)育成功能大孢子,單核胚囊經(jīng)第三次有絲分裂形成八核胚囊,在珠孔端2個助細胞和1個卵細胞組成卵器,合點端有3個反足細胞呈品字形排列,中間有1個中央細胞(含兩個極核),香水檸檬雌配子體發(fā)育屬蓼形。
　　4、對香水檸檬和白花檸檬進行人工授粉試驗,香水

5、檸檬自交后切片觀察未見胚胎發(fā)育,可形成無籽果實;白花檸檬自交后果實有籽;以香水檸檬為父本雜交后果實有籽,說明香水檸檬花粉可育;以白花檸檬為父本雜交后胚胎發(fā)育正常形成有籽果實,說明香水檸檬胚囊可育;香水檸檬去雄不授粉可得無籽果實,說明香水檸檬具有單性結(jié)實能力。
　　5、以香水檸檬為母本進行自交、雜交授粉,采集的雌蕊經(jīng)固定、苯胺藍染色后,在熒光顯微鏡下觀察花粉生長情況。結(jié)果表明,授粉后2-4h花粉開始萌發(fā),白花檸檬的花粉生長良好48

6、h后到達花柱下部,72-96h到達珠孔并完成雙受精;香水檸檬自交后花粉可以萌發(fā)并伸入柱頭組織,但是伸長至柱頭下部出現(xiàn)卷曲、膨大、甚至破裂,很少見花粉管伸長至花柱。說明香水檸檬具有很強的自交不親和性。
　　6、對香水檸檬自交、雜交和不授粉的柱頭/花柱轉(zhuǎn)錄組測序后,采用de novo組裝到61,224個unigene,平均長度948bp,N50為1457bp,共47,260個注釋到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和G

7、O數(shù)據(jù)庫。分析3個樣品基因的表達差異,在自交樣品中有1356個較另外兩樣品表達上調(diào),其中包括F-box基因CL2009contig1;雜交樣品中有757個較另外兩樣品表達上調(diào),1452個表達下調(diào),下調(diào)基因中包括核糖核酸酶基因unigene14715和unigene17211。這些差異基因參與的生物學(xué)過程涉及:花粉管生長(GO:009860)、繁殖過程(GO:0022414)、細胞死亡(GO:0008219)和定位功能(GO:005117

8、9)等。
　　7、克隆核糖核酸酶基因unigene14715和unigene17211全長,分別命名為ClS1、ClS2;F-box基因CL2009contig1,命名為ClF-box。對比香水檸檬和白花檸檬ClS1基因,發(fā)現(xiàn)ClS1基因轉(zhuǎn)錄后在兩個品種中發(fā)生了不同剪接,香水檸檬ClS1基因有一個內(nèi)含子編碼177個氨基酸,而白花檸檬無內(nèi)含子僅編碼118個氨基酸,氨基酸差異將影響蛋白質(zhì)功能,推測香水檸檬的花粉在白花檸檬雌蕊上親和可能

9、與ClS1基因的變異有關(guān)?；蛲幢葘Ψ治鲲@示,ClS1、ClS2基因與茄科植物林煙草、矮牽牛及豆科模式植物蒺藜苜蓿的自交不親和核糖核酸酶基因親緣關(guān)系較近;ClF-box基因與草莓等薔薇科植物S位點F-box基因聚為一類。
　　8、采用熒光定量分析ClS1、ClS2基因和ClF-box基因表達模式,結(jié)果顯示ClS1、ClS2基因在雌蕊中特異表達,其中柱頭表達量最高,其次是花柱;ClF-box基因在花藥中特異表達;3個基因自交授粉后

10、在雌蕊的表達量高于雜交授粉后,ClS1、ClS2基因在自交授粉4h后表達量最大,ClF-box基因在自交授粉3d表達量最大。
　　9、以In-Fusion試劑構(gòu)建植物表達載體,通過農(nóng)桿菌侵染法將ClS1、ClS2基因和ClF-box基因轉(zhuǎn)入煙草,獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。
　　10、對檸檬61,224個unigene進行微衛(wèi)星(SSR)分布特征分析,共檢測到13,318個SSRs序列位點,分布于10,628條unigene,SSR