河川沙塘鱧人工育苗的關鍵因子研究及鴨綠沙塘鱧線粒體DNA基因組分析.pdf

1、河川沙塘鱧(Odontobutis potamophlia)和鴨綠沙塘鱧(Odontobutisyaluensis)均是隸屬于鱸形目(Perciformes)、蝦虎魚亞目(Gob io idei)、沙塘鱧科(Odontobutidae)、沙塘鱧屬(Odontobutis)的魚類。河川沙塘鱧和鴨綠沙塘鱧其肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛，具有較為廣闊的開發(fā)和利用前景，目前已經(jīng)成為我國重要的人工增養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。但目前沙塘鱧人工育

2、苗技術還不穩(wěn)定，急需攻克該魚人工育苗的關鍵技術。本文通過對河川沙塘鱧人工繁育過程中幾個關鍵因子的研究，為該魚的人工規(guī)模化繁育提供重要的參考資料。同時通過克隆鴨綠沙塘鱧線粒體DNA全長并分析其結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建河川沙塘鱧和鴨綠沙塘鱧等22種塘鱧魚類的系統(tǒng)進化樹，為研究塘鱧魚類系統(tǒng)發(fā)育關系及起源演化提供基礎資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.河川沙塘鱧早繁技術研究
　　在11月份，選擇一齡以上的河川沙塘鱧作為親本，在室內(nèi)升溫培育，使親

3、本所處環(huán)境比同期室外水溫高。經(jīng)過21天在不同溫度下的積溫培育，解剖親魚觀察發(fā)現(xiàn)，雌性親魚卵呈圓球形，半透明，淡黃色或金黃色，卵中有數(shù)百個大小不等的油球，雄性親魚精巢呈乳白色，飽滿而亮澤，生殖乳突明顯呈紅色，即親魚性腺快速發(fā)育，性腺成熟，可以實現(xiàn)河川沙塘鱧提早繁殖。其中，在24℃的水溫下培育的河川沙塘鱧產(chǎn)卵量最高，達到一尾雌魚平均可產(chǎn)卵1547粒。
　　2.溫度對河川沙塘鱧胚胎發(fā)育的影響
　　將河川沙塘鱧受精卵置于不同水溫下(

4、15、18、21、24、27和30℃)發(fā)育，用顯微鏡觀察記錄胚胎發(fā)育到不同時期所需的時間。結(jié)果表明，隨著溫度的降低，胚胎的發(fā)育進程會越來越遲緩。當水溫降低到15℃以下時，部分受精卵會在孵化前的囊胚-原腸胚期停滯，無法正常發(fā)育至孵化。在15℃-30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，河川沙塘鱧受精卵發(fā)育到各個時期的時間越來越短，但是在達到30℃時，胚胎發(fā)育多出現(xiàn)畸形，并相繼死于體節(jié)期。當溫度在27℃時，雖然胚胎發(fā)育速度較快，但畸形率較高，達9.7％

5、;當溫度在18℃-24℃時只有極少量的胚胎發(fā)生畸形。通過比較不同水溫的胚胎孵化率，發(fā)現(xiàn)在24℃時孵化率最高(83.7％);18℃和21℃的孵化率也較高（70％以上）;15℃和27℃的孵化率較低(40％-60％)。30℃的孵化率最低(13％)。綜合孵化時間、孵化率和畸形率等因素，21℃-24℃是河川沙塘鱧胚胎發(fā)育的最適溫度范圍。
　　3.河川沙塘鱧受精卵水霉病的防治研究
　　挑選正常發(fā)育的河川沙塘鱧受精卵，分別用2.0、4.0

6、、8.0、16.0和32.0 mg/L的高錳酸鉀溶液、亞甲基藍溶液和氯化鈉溶液處理，觀察受精卵的發(fā)育情況。實驗發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍在4.0-32.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，胚胎的水霉感染率低于10％，氯化鈉在16.0-32.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，胚胎的水霉感染率低于10％，高錳酸鉀在2.0-32.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，胚胎的水霉感染率一直高于40％。由此說明亞甲基藍和高濃度的氯化鈉都可以有效控制水霉，但是經(jīng)過高濃度的氯化鈉處理的河川沙

7、塘鱧受精卵，最終出膜率低于20％。而亞甲基藍在4.0-8.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，出膜率在80％以上。綜合水霉感染率和孵化率，亞甲基藍對河川沙塘鱧胚胎水霉病預治效果最好，高錳酸鉀次之，氯化鈉最差。
　　4.鹽度對河川沙塘鱧幼魚存活和生長的影響
　　設置6組不同鹽度梯度（0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0‰）對河川沙塘鱧幼魚存活和生長的影響研究，河川沙塘鱧在不同鹽度下其特定生長率由高至低依次為4.0＞2.0＞6

8、.0＞8.0＞10.0＞0.0‰。鹽度為4.0‰特定增長率最高，即河川沙塘鱧幼魚在4.0‰生長最快。鹽度為0.0‰時，幼魚生長極其顯著慢于其他鹽度組。而且隨著時間的推移，各鹽度之間的特定增長率差異逐漸減小，即低鹽水在前期刺激了幼魚快速生長。在2.0-6.0‰鹽度范圍內(nèi)，河川沙塘鱧在35d內(nèi)的成活率變化在61.67％-85.00％之間，在鹽度10‰成活率較低，僅為13.33％，在鹽度0.0‰成活率為73.33％。表明在鹽度0.0-6.0‰

9、范圍內(nèi)，河川沙塘鱧幼魚可以正常存活、生長。綜合存活率和特定增長率，在鹽度2.0-4.0‰范圍內(nèi)河川沙塘鱧幼魚的生長最快且有較高的存活率。
　　5.鴨綠沙塘鱧線粒體DNA全長的克隆
　　通過PCR技術克隆得到鴨綠沙塘鱧線粒體DNA序列，全長為16，909bp，由13個蛋白質(zhì)基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因，2段主要的非編碼區(qū):輕鏈復制起始區(qū)和控制區(qū)(D-loop)，以及散布于各基因之間的非編碼序列組成。鴨綠沙塘鱧線粒

10、體DNA序列堿基含量為A(30.48％)，C(28.99％)，G(15.28％)，T(25.25％)，AT含量(55.73％)略高于GC(44.27％)，與多數(shù)脊椎動物類似。
　　6.基于線粒體全長基因序列研究塘鱧魚類的系統(tǒng)進化關系
　　從GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索和下載得到已公布的21種塘鱧魚類線粒體全基因組序列，與本文克隆得到的鴨綠沙塘鱧線粒體全基因組用MEGA

11、5.0軟件采用鄰接法NJ和最大似然法ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中中華沙塘鱧(Odontobutis sinensis)與斑尾復蝦虎魚(Syne chogob ius ommaturus)的遺傳距離最大為0.333，云斑尖塘鱧(Oxyeleotris marmorata)與線紋尖塘鱧(Oxyeleotris lineo latus)的遺傳距離最小為0.022。鴨綠沙塘鱧與河川沙塘鱧的遺傳距離為0.092，河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧與平