河川沙塘鱧主要抗氧化指標(biāo)及其MN-SOD基因的表達(dá)分析.pdf

1、河川沙塘鱧(Odontobutis potamophlia)是我國特有的一種淡水底棲小型肉食性魚類，肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩，屬上品魚類。近年來深受江蘇、浙江、上海等地居民的喜愛，市場(chǎng)價(jià)格堅(jiān)挺，已成為一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。
　　本研究以河川沙塘鱧為研究對(duì)象，通過酶學(xué)、分子生物學(xué)等研究方法，檢測(cè)了河川沙塘鱧胚胎到仔魚不同發(fā)育時(shí)期的主要抗氧化指標(biāo)，研究了其Mn-SOD基因的表達(dá)變化規(guī)律，為優(yōu)化該魚人工育苗及養(yǎng)殖提供了一定的參考資料。

2、主要研究結(jié)果如下:
　　1、在河川沙塘鱧早期發(fā)育階段，體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性及谷胱甘肽(GSH)的含量總體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。具體結(jié)果為:(1)受精卵時(shí)期SOD活性最低，為(5.158±0.022)U/mg prot，桑椹胚時(shí)期明顯升高，為(9.124±0.087)U/mg prot，在隨后的原腸胚時(shí)期略微降低之后一直呈上升趨勢(shì)，至孵化3天時(shí)SOD活性為(15.030±0.091)U/mg prot。

3、(2)CAT的活性在受精卵到桑椹胚這一發(fā)育階段呈下降趨勢(shì)，達(dá)到最低值為(37.485±8.574)U/mg prot，但是下降程度不明顯。之后的發(fā)育階段一直呈上升趨勢(shì)，孵化3天時(shí)CAT活性可達(dá)(177.080±10.610)U/mg prot。(3)受精卵時(shí)期到原腸胚期的GSH含量維持在較低的水平，上升趨勢(shì)不明顯，神經(jīng)胚期之后的GSH含量有較顯著的升高，體節(jié)期到口裂期這一階段GSH的含量有明顯上升，直到孵化后3天都維持有較快的增長。最低

4、含量為桑椹胚時(shí)期，即為(0.394±0.030)mg GSH/L，最高為孵化3天，值為(3.086±0.022)mg GSH/L。結(jié)果表明河川沙塘鱧早期發(fā)育階段其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮相應(yīng)的作用，為胚胎正常發(fā)育提供保障。
　　2、采用RACE等方法克隆出河川沙塘鱧Mn-SOD基因的全長序列為1008bp(Genebank登錄號(hào)KU845215)包括678bp開放閱讀框(ORF)，15bp的5'UTR區(qū)和315bp的3'UTR區(qū)，并且

5、具有脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)AATAAA和31bp的PolyA尾巴，推測(cè)該序列編碼225個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的氨基酸分子量為25153.50，理論等電點(diǎn)為8.30。氨基酸序列分析表明其含有一個(gè)Mn-SOD基因的特征片段(DVWEHAYY)，一個(gè)27bp的線粒體定位靶序列(MLCRASQIRRCATGLSHSLSQVTTSRQ)。兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域Sod_Fe_N(28-109)和Sod_Fe_C(116-219)，兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(100NHT

6、I103，215NVSD218)。4個(gè)保守的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(H53，H101，D186，H190)。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示河川沙塘鱧Mn-SOD有59％的α-螺旋，10％的β-折疊，16％的無規(guī)則卷曲。推導(dǎo)得到的河川沙塘鱧Mn-SOD基因的氨基酸序列分析表明，河川沙塘鱧和其他物種Mn-SOD的相似性在51.6-90.3％之間，其中與同為鱸形目的條石鯛和線鱧相似性最高，均為90.3％，相似性最低的魚類是斑馬魚，為87.1％。
　　3、采

7、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)健康河川沙塘鱧不同組織Mn-SOD基因表達(dá)的特異性。結(jié)果顯示，腎、肝、肌肉、腦、脾、鰓、眼、心臟8個(gè)組織中Mn-SOD基因都有表達(dá)。其中在肌肉、肝、心、腦、眼5個(gè)組織中的表達(dá)量較高，在腎、脾、鰓3個(gè)組織中的表達(dá)量較低。在河川沙塘鱧胚胎到仔魚不同發(fā)育時(shí)期，Mn-SOD基因都有表達(dá)。其中桑椹胚期表達(dá)量最高，之后逐漸降低，并顯著低于受精卵時(shí)期，而仔魚孵化后表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。
　　4、急性

8、亞硝酸鹽脅迫處理河川沙塘鱧后，其肝組織內(nèi)Mn-SOD基因的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。脅迫后1h，表達(dá)水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，3h后表達(dá)量顯著升高，達(dá)到最高值，之后表達(dá)量略有降低，6-24h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的保持在較高水平，48h之后表達(dá)量開始持續(xù)下降，72h后降到最低值。而鰓組織內(nèi)Mn-SOD基因的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出先降低后升高然后再降低的變化規(guī)律。其中，0-6h之內(nèi)的表達(dá)量持續(xù)降低，12-48h之內(nèi)略有上升，24h的時(shí)候達(dá)到最高值，之