高產(chǎn)蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文高產(chǎn)蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究姓名：張春楊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：牛鐘相常維山2001.6.1高產(chǎn)蛋白酶益生菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究摘要菌種是益生素產(chǎn)品質(zhì)量和應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素之～。長(zhǎng)期以來(lái)，各國(guó)都在尋求自己的菌源。本研究從山東泰安不同飼養(yǎng)場(chǎng)采集鏈康動(dòng)物的糞便或腸內(nèi)容物以及肥沃的土壤進(jìn)行了產(chǎn)蛋白酶芽胞桿菌的分離，在產(chǎn)酶特性研究和動(dòng)物安全試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出產(chǎn)酶較高的H1株，并進(jìn)行了鑒定

2、。然后利用H1菌株在特定條件下制各成益生素(高產(chǎn)蛋自酶的益生素)，并進(jìn)行了動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該益生素具有良好的蝤床應(yīng)且效果。體研究共分三部分：第一部分，菌種篩選。采集山東省泰安市不同飼養(yǎng)場(chǎng)的健康動(dòng)物(牛、豬、雞)的糞便或腸內(nèi)容物共32頭份以及山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)菜田中肥沃的土壤3份，稀釋】0。～】02后，】00℃處理5rain以殺滅非芽胞菌，然后用酪素水解培養(yǎng)基共分離出產(chǎn)蛋白酶的芽胞桿菌44株。對(duì)于酪素水解圈較大(2cm)的13株菌，

3、用Folin法測(cè)定其產(chǎn)生的蛋白酶活力，進(jìn)一步篩選到產(chǎn)蛋白酶活力較高的Hl菌株，在48h發(fā)酵液中可產(chǎn)生103256U／ml的蛋白酶。通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶特性的研究發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵培養(yǎng)基中48h產(chǎn)酶最多，活力可達(dá)109905U／ml；而培養(yǎng)基的pH值對(duì)細(xì)菌產(chǎn)酶有直接的影響，在PH65～80之間，產(chǎn)酶隨pH值的增高而減少在pH65時(shí)，產(chǎn)酶較高，可達(dá)125940U／ml。在pH72的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)量在0～48h內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，36h時(shí)細(xì)菌開(kāi)始形成芽胞

4、體，到48h達(dá)穩(wěn)定期活菌數(shù)量在此時(shí)達(dá)最高值(12109CFU／m1)：而pH值的變化趨勢(shì)是，在12h內(nèi)迅速降至652，然后緩慢升高至814。H1菌株所產(chǎn)蛋白酶為高溫中性蛋白酶，在pH75和50“C下活力最高，最高值為165444U／ml，在體況(pH75，40“C)下也能達(dá)158404U／ml的活力。Bulb／C小鼠腹腔注射和海蘭白公雛口服試驗(yàn)均表明，該菌對(duì)動(dòng)物安全。第二部分，菌種鑒定。對(duì)篩選出的Hl菌株進(jìn)行培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、生理生化

5、等方面的鑒定，并進(jìn)行了石蕊牛乳試驗(yàn)、吸氧力試驗(yàn)和藥物敏感試驗(yàn)。根據(jù)tiff杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》并結(jié)合H1菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性，鑒定H1菌株為枯草芽胞桿菌。石蕊牛乳試驗(yàn)表明，在石蕊牛乳培養(yǎng)基中，該菌優(yōu)先利用乳糖產(chǎn)酸，其次分泌蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)。吸氧力試驗(yàn)表明，該菌具有較強(qiáng)的吸氧力，可以促進(jìn)厭氧菌的生長(zhǎng)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌除對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性外，對(duì)其他多種抗菌藥均敏感。第三部分，菌種應(yīng)用。將Hl菌株利用改良培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，然后制