基于龍眼轉(zhuǎn)錄組的SSR引物開發(fā)與應(yīng)用研究.pdf

1、以‘紅核子’龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記研究，共計(jì)開發(fā)多態(tài)性引物11對(duì)，完成EST-SSR-PCR試驗(yàn)體系的優(yōu)化，將所優(yōu)化的EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于龍眼的親緣關(guān)系分析，并與ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行比較分析。具體研究結(jié)果如下：
　　1、龍眼EST-SSR位點(diǎn)特征分析
　　以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料，經(jīng)MISA軟件的SSR位點(diǎn)檢索與分析，共檢索出5710個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，且EST-S

2、SR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為8.28％，位點(diǎn)間平均距離為5.41 kb，包含796種基元。從數(shù)量上分析，二核苷基元和三核苷基元所占比例最大，分別為43.35%和32.73%，二者共占總EST-SSR位點(diǎn)的76.08%，為優(yōu)勢(shì)核苷基元。從EST-SSR位點(diǎn)的基元種類來看，六核苷基元與五核苷基元的種類最多，分別為389種和244種，所占比例分別為48.87%和30.65%，二者占全部EST-SSR基元種類的79.52%。EST-SSR位點(diǎn)的檢索結(jié)果還

3、表明，二核苷酸基元中，(AG)n=(TC)n和(CT)n=(GA)n所占比例分別為17.55%和15.17%，是優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型；而(CG)n=(GC)n重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最低，僅為0.00725%，表現(xiàn)出明顯的GC偏倚性；在三核苷基元中，(AGA)n=(TCT)n是最優(yōu)重復(fù)類型，占總EST-SSRs的比例為2.92%，其次為(CTT)n=(GAA)n、(AAG)n=(TTC)n，所占比例分別為2.71%、2.59%。綜上，紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄

4、組序列中EST-SSR位點(diǎn)含量豐富。
　　2、龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化
　　通過L16(44)正交試驗(yàn)，得到龍眼EST-SSR-PCR的最優(yōu)應(yīng)體系為：DNA模板80 ng，0.15 mmol/L dNTPs2μL，0.1μmol/L上下游引物各1μL，Tap酶1.5 U；非優(yōu)化試驗(yàn)因素10×PCR Buffer（1.5mM Mg2+）2.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。分別隨機(jī)選取3對(duì)引物和8份龍眼種質(zhì)樣本的D

5、NA作為模板對(duì)該優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示：擴(kuò)增條帶清晰平整、無引物二聚體、無非特異擴(kuò)增、背景干擾小，說明得到的優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。
　　3、龍眼EST-SSR多態(tài)性分析
　　依據(jù)所分析的龍眼EST-SSR位點(diǎn)序列特征，使用Primer Premier5軟件共設(shè)計(jì)50對(duì)長(zhǎng)度在18-24 bp的引物，引物對(duì)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100-300 bp。再以‘立冬本’的 DNA為模板，對(duì)所設(shè)計(jì)引物的可用性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示50對(duì)引物中

6、共有19對(duì)的擴(kuò)增片段符合預(yù)期大小。進(jìn)一步以95份供試龍眼種質(zhì)的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，其中有11對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性良好，主帶明亮清晰，無拖尾、無彌散、背景干擾小，多態(tài)性引物開發(fā)得率達(dá)22%。這11對(duì)引物在95份龍眼種質(zhì)中的擴(kuò)增多態(tài)性表現(xiàn)為：共獲得114條譜帶，多態(tài)性位點(diǎn)比例達(dá)100%；多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量分布范圍在5-25個(gè)，其中LY-43引物對(duì)所擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最多（共25個(gè)），LY-9引物對(duì)

7、的多態(tài)性位點(diǎn)最少（僅5個(gè)）；平均每個(gè)龍眼EST-SSR標(biāo)記能夠擴(kuò)增10.36條多態(tài)性譜帶，說明基于紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有豐富多態(tài)性。
　　4、龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析
　　本試驗(yàn)分別運(yùn)用EST-SSR與ISSR對(duì)95份供試龍眼種質(zhì)進(jìn)行了親緣關(guān)系研究。EST-SSR分子標(biāo)記開發(fā)的11對(duì)引物對(duì)供試龍眼材料擴(kuò)增譜帶的分布范圍為5-25條，分布范圍較廣，每對(duì)引物的平均多態(tài)位點(diǎn)為10.36個(gè)；I

8、SSR分子標(biāo)記所使用的10對(duì)UBC引物對(duì)供試龍眼材料擴(kuò)增譜帶分布范圍8-12條，分布范圍較窄，每對(duì)引物的平均多態(tài)位點(diǎn)為9.50個(gè)；EST-SSR擴(kuò)增的平均多態(tài)性位點(diǎn)比ISSR多。此外，電泳結(jié)果表明EST-SSR標(biāo)記所開發(fā)的特異引物比ISSR分子標(biāo)記通用UBC引物更能高效結(jié)合到樣本DNA；從開發(fā)所得的11對(duì)EST-SSR引物中獲得5對(duì)特異標(biāo)記：LY-5、LY-38、LY-43、LY-45、LY-48，若加大龍眼EST-SSR特異標(biāo)記引物的

9、開發(fā)力度，將有利于龍眼種質(zhì)資源的鑒別。
　　基于EST-SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果顯示95份供試龍眼種質(zhì)能被有效區(qū)分，聚類結(jié)果為2大組、8類群。其中，‘荔枝龍眼’單獨(dú)聚為一組，表明其遺傳背景獨(dú)特，有別于其他龍眼種質(zhì)；‘荔枝龍眼’和‘荔龍’不是同一品種。一些地方品種如‘南安1號(hào)’和‘農(nóng)科所3號(hào)’被聚類在一起，表明其遺傳背景相似；供試的東壁龍眼種質(zhì)被聚類為不同的類群，說明不同東壁品種龍眼之間仍存在遺傳多態(tài)性；此外也揭示出個(gè)別品種如‘碼頭1號(hào)