sp18族精子膜蛋白基因的克隆及其介導(dǎo)精子親和捕捉外源DNA的初步研究.pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文sp18族精子膜蛋白基因的克隆及其介導(dǎo)精子親和捕捉外源DNA的初步研究姓名：柏家林申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生理學(xué)指導(dǎo)教師：陳永福2002.6.1spl8族精子膜蛋白基因的克隆及其介導(dǎo)精子親和捕捉外源DNA的初步研究桿菌BL2I(DE3)中得到誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子量約為165kD，表達(dá)量約占菌體總蛋白的32％。重組spl8誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物與spl8mAb的westernblot分析表明spl8mAb能識(shí)別重組的

2、spl8膜蛋白，表達(dá)的重組蛋白具有免疫原性，為進(jìn)一步研究spl8蛋白的功能打下了基礎(chǔ)。3、應(yīng)用PCR擴(kuò)增spl8cDNA上約537bp片段作探針，對(duì)昆明白小鼠睪丸、附睪、大腦、肝、腎、肌肉和卵巢等7種組織中spl8精子膜蛋白所編碼的mRNA的組織特異性表達(dá)進(jìn)行了研究。7種組織總RNA的Northernblot表明，spl8精子膜蛋白所編碼的mRNA僅在睪丸和附睪中表達(dá)，其大小約為20kb。4、用純化的重組spl8蛋白作抗原制作了抗家兔多

3、抗(spl8IgG)，spl8mAb和spl8IgG在小鼠精子表面的間接免疫熒光定位研究表明，spl8精子膜蛋自主要分布在精子頭后部，在精子尾部前段也有該種蛋白的分布。初步證明，spl8蛋白是精子頭后部和尾部前段比較廣泛存在的一種膜蛋白。spl8IgG可引起牛和小鼠精子頭并頭的凝集作曝，表明spl8蛋白與精子的運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。5、應(yīng)用我室克隆的牛精蛋白基因PGEM—T—bpro質(zhì)粒，用引物P5(帶有BamHI酶切位點(diǎn))和P6(帶有Ec

4、oRI酶切位點(diǎn))可擴(kuò)增正常的牛精蛋白基因bpro。設(shè)計(jì)一條引物P7(同樣帶有EcoRI酶切位點(diǎn))，將bpro基因終止密碼TAA突變?yōu)镃AG，由引物Ps和P，可擴(kuò)增出約168bp的用于構(gòu)建融合基因的牛精蛋白基因mbpro。將mbpro基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET一30a()一spl8／EcoRlBamHI位點(diǎn)，構(gòu)建了pET一30a()一spl8／mbpro融合基因的原核表達(dá)載體。融合基因在大腸桿菌BL2l(DE3)中得到誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)

5、產(chǎn)物的表觀分子量約為26kD，表達(dá)量約占菌體總蛋白的16％。westernblot分析表明，spi8mAb和spl8IgG能識(shí)別誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白。6、DNA結(jié)合蛋白的凝膠滯后實(shí)驗(yàn)表明，純化的spi8／mbpro重組融合蛋白能結(jié)合537bp到5959bp的外源DNA(包括線性質(zhì)粒DNA和環(huán)狀質(zhì)粒DNA)，為下一步融合蛋自的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。7、初步研究表明spl8／mbpro融合蛋白一spl8mAb與精子和外源DNA共孵育后精子表面結(jié)合D