27034.深海沉積物微生物元基因組文庫來源的新的酯酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

1、中國科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文指導(dǎo)教師塞室型硒究旦盟史國型堂醫(yī)邀生塑硒究壓申請學(xué)位級別亟學(xué)科專業(yè)名稱運(yùn)佳堂論文提交日期星Q!Q：魚論文答辯日期窒Q!Q：魚培養(yǎng)單位史國科堂院邀生物巫窺壓學(xué)位授予單位生墾型堂院亞究生院答辯委員會主席生物，極大限制了人類對微生物遺傳資源的有效利用?，F(xiàn)代生物科技以及嚴(yán)峻的能源危機(jī)對新型工業(yè)用酶的需求日益旺盛，極大的促進(jìn)了新型開發(fā)環(huán)境遺傳資源技術(shù)手段的發(fā)展。而元基因組技術(shù)作為一種不依賴于培養(yǎng)的新理念和新方法，可以

2、克服上述瓶頸，使從探究環(huán)境中獲得大量未能培養(yǎng)的微生物成為現(xiàn)實(shí)。本研究的目的是從深海沉積物微生物元基因組文庫中克隆新的酯酶基因，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。本研究中，我們利用含有三丁酸甘油酯的酯酶選擇性篩選培養(yǎng)基，從深海沉積物微生物元基因組文庫中篩選得到酯酶陽|生Fosmid克隆。對篩選得到的fosmidFLIO進(jìn)行部分酶切構(gòu)建亞克隆文庫，篩選得到酯酶陽性亞克隆pFLSIO。PCR擊)。增目的片段后與pET28a連接構(gòu)建酯酶基因原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化

3、大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21。純化表達(dá)產(chǎn)物并對其進(jìn)行活性測定及酶學(xué)性質(zhì)研究。序列分析顯示該pFLSl0亞克隆質(zhì)粒含有一段924bp的ORE(OpenReadingFrame)，與一海洋元基因組文庫中篩選出的酯酶ADA70030序列一致性為7l％。該酶為一新的低溫酯酶，對C4底物(對硝基苯丁酸酯)水解能力最強(qiáng)。該酶最適作用溫度為20℃，最適作用pH為75，20℃時較為穩(wěn)定，pH8—10的范圍內(nèi)有良好的pH穩(wěn)定性，l、

4、M92對該酶具有一定的激活作用，Mn2等對其具有不同程度的抑制作用。應(yīng)用元基因組技術(shù)篩選到了新的酯酶基[]fls，O并進(jìn)行了克隆表達(dá)，該酶在低溫及堿性條件下較為穩(wěn)定且活力較高，對于工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用潛力。從環(huán)境中發(fā)掘重要的工業(yè)用酶用于工業(yè)應(yīng)用，有利于節(jié)約原材料、節(jié)省能源，對于促進(jìn)工業(yè)化發(fā)展和經(jīng)濟(jì)增長具有重要意義，同時也為開發(fā)海洋微生物的其它重要功能基因提供有力借鑒，為尋求海洋微生物資源最大限度挖掘、可持續(xù)開發(fā)利用的科學(xué)途徑奠定理論