重組甜菜夜蛾核多角體病毒SeLV1的研究.pdf

1、該文通過(guò)同源重組的方法,缺失了甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因組中的非必需基因--脫皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecdysteroid UDP glucosyl transferase,egt),并將綠色熒光蛋白基因(green fluorecentprotein,gfp)整合在egt基因位點(diǎn),構(gòu)建得到了重組病毒SeLV1

2、.然后對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定分析,為繼續(xù)構(gòu)建高效的重組桿狀病毒殺蟲(chóng)劑提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ).在野生型SeMNPV中存在缺失了不同片斷的多種基因型.為了構(gòu)建重組病毒SeLV1,首先通過(guò)蟲(chóng)體克隆的方法,從SeMNPV的野外分離株SeUS1中分離得到了具有SeMNPV完整基因組的基因型克隆--SeC,用多種限制性內(nèi)切酶對(duì)其基因組進(jìn)行REN分析,所得的酶切圖譜中均無(wú)亞克分子帶出現(xiàn),證明其具備了完整的病毒基因組.為了便于篩選分離重組病毒,將報(bào)告基因

3、gfp插入到egt基因的上下游側(cè)翼序列之間,并以克隆載體pUC18為基礎(chǔ),構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pEGT-GFP<'+>.為確保基因能順利表達(dá),還在其起始密碼子ATG前插入了苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的多角體基因的啟動(dòng)子.用構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pEGT-GFP<'+>和具有完整基因組的SeC的DNA,通過(guò)脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Se3

4、01細(xì)胞.在熒光顯微鏡下可以觀察到部分被感染的細(xì)胞有綠色熒光產(chǎn)生,證明重組成功.在GFP篩選標(biāo)記的幫助下,利用空斑純化法分離得到了重組病毒SeLV1.對(duì)其基因組進(jìn)行的REN和Southern blot分析證明gfp基因已經(jīng)成功地整合在egt基因位點(diǎn),但同時(shí)在原來(lái)Pst I-C片斷上發(fā)現(xiàn)存在6.9kb的缺失.通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)SeLV1的多角體大小不均一,和SeC的多角體存在較大差異.口服感染甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)證明,SeLV1已經(jīng)失去了對(duì)甜