股骨頭缺血性骨壞死骨細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、缺血性骨壞死目前已成為一種常見病，尤其是股骨頭壞死致殘率最高。目前對該病的認(rèn)識有了很大的提高，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，除已知創(chuàng)傷等病因外，其余病因和發(fā)病機(jī)理復(fù)雜而不明確。對其發(fā)生機(jī)制國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了基礎(chǔ)和臨床研究，提出了各種學(xué)說，從不同的側(cè)面闡述了各自的觀點。盡管非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理機(jī)制仍不清楚，但與創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理改變十分相似，認(rèn)為均由于局部缺血后，骨及骨髓成分出現(xiàn)壞死。以細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)為基礎(chǔ)來闡述其病理改變有助于對非

2、創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理機(jī)制的了解。缺血是凋亡的常見誘導(dǎo)因素之一，目前腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面的文獻(xiàn)較多，在缺血性損傷研究中，心、肝、腎等臟器的細(xì)胞死亡亦與細(xì)胞凋亡有關(guān)，但缺血后骨組織是否存在凋亡國內(nèi)外未見報導(dǎo)，了解局部缺血后骨組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，探明缺血性骨壞死的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本實驗通過建立缺血性骨壞死的動物模型及觀察由于股骨頸骨折行人工關(guān)節(jié)置換時取出的股骨頭，檢測骨組織中是否存在細(xì)胞凋亡及缺血時間與凋亡程度的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上

3、進(jìn)一步觀察Bcl-2、Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的相關(guān)性，旨在探討B(tài)cl-2，Bax對缺血性骨組織細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)方面探討缺血性骨壞死的發(fā)病機(jī)制。 材料和方法: 1.實驗對象及處理因素 SD大鼠35只，雄性，體重280～300g(由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供)。2％戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉，手術(shù)在無菌條件下進(jìn)行，左側(cè)髖部為手術(shù)側(cè)，右側(cè)為對照側(cè)，切開左側(cè)關(guān)節(jié)囊，切斷股骨頭圓

4、韌節(jié)，使髖關(guān)節(jié)脫位，于大粗隆下20mm處截斷股骨，剝離軟組織，而后放置股骨近端于原位，縫合皮膚，不做內(nèi)外固定。分別于術(shù)后3h、6h、12h、24h、72h各處死7只，取出兩側(cè)股骨近端，4％多聚甲醛固定，20％EDTA(PH7.4)，4℃脫鈣2-3周，以針刺法檢查至脫鈣完全，而后石臘包埋。臨床收集21例股骨頸骨折需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭。病例均來自中國醫(yī)大一院骨科，男6例，女15例，年齡：62-83歲，取材時距骨折的時間3天-3周。

5、將股骨頭沿冠狀面剖開，切成厚約5mm骨片，4％多聚甲醛固定24h，20％EDTA(PH7.4)，4℃脫鈣3-4周，每3天更換脫鈣液，以針刺法檢查至脫鈣完全，而后石臘包埋。 2.試劑來源： 凋亡檢測試劑盒及兔抗大鼠Bc1-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體及生物素化抗地高辛抗體IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司。 3.觀察指標(biāo)： ①HE染色；②透射電鏡觀察；③DNA凝膠電泳(瓊脂糖凝膠電泳分析DNA斷裂)；

6、④末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記[Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTP nick end labeling，TUNEL]法檢測凋亡細(xì)胞；⑤免疫組化檢測Bcl-2、Bax表達(dá)；⑥計算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)(型號：MetaMorph/DPl0/BX41，生產(chǎn)廠：UIC/OLYMPUS/US/JP)處理，x2檢驗和t檢驗，統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果: 1.動物實驗

7、部分HE染色形態(tài)學(xué)改變：缺血3h，6h骨小梁內(nèi)骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，缺血12h：骨髓內(nèi)細(xì)胞可見變性壞死，部分骨細(xì)胞壞死，缺血24h：成骨細(xì)胞消失，缺血72h：可見軟骨細(xì)胞壞死。(2)透射電鏡：缺血12h及24h，細(xì)胞固縮，染色質(zhì)濃聚裂解，胞漿內(nèi)小泡及凋亡小體形成，細(xì)胞核可見邊集現(xiàn)象。(3)瓊脂糖凝膠電泳：本實驗缺血12h、24h標(biāo)本提取DNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見到相同的“梯狀”條帶，梯狀條帶是凋亡細(xì)胞DNA片段化(f

8、ragmentation)的結(jié)果，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶(endonuclease)將核小體間的連接DNA降解，形成長度為180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其它核內(nèi)蛋白質(zhì)不降解，核基質(zhì)也不改變，由于大部分細(xì)胞凋亡出現(xiàn)DNA梯狀條帶，而細(xì)胞壞死時DNA隨意斷裂為長度不一的片段，瓊脂凝糖膠電泳呈“彌散狀”(Smear)。本實驗中缺血72h即可見“彌散狀”條帶。(4)TUNEL陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)測定：缺血6h、12h、24h組均可檢

9、測到TUNEL陽性骨細(xì)胞，并與缺血3h、72h組對照，x2檢驗，有顯著性差異(p<0.01)。缺血3h可見Bcl-2及Bax陽性表達(dá)，缺血6h時Bcl-2/Bax增高，缺血12h，24h時Bcl-2/Bax下降，缺血72h時，Bcl-2及Bax均呈弱陽性表達(dá)。 2.臨床研究部分DNA凝膠電泳可見特征性“梯狀”(ladder)條帶，骨小梁骨細(xì)胞及骨髓細(xì)胞均有TUNEL檢測陽性細(xì)胞，統(tǒng)計學(xué)分析凋亡細(xì)胞與Bax表達(dá),t檢驗有相關(guān)性(p