BMSCs移植治療早期股骨頭缺血性壞死的初步臨床研究.pdf

1、背景與目的：
　　 股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)是骨科常見病,病程長且致殘率高。由于其發(fā)病機制尚未完全闡明,治療比較困難,晚期多行人工關(guān)節(jié)置換,因此早期ANFH的治療是關(guān)鍵。如何有效治療早期ANFH,防止疾病進一步發(fā)展,延緩股骨頭塌陷,一直是骨科研究的熱點。近年來研究表明,ANFH與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell

2、s,BMSCs)有著密切關(guān)系,認(rèn)為是由于BMSCs的減少,導(dǎo)致的修復(fù)重建不足而引起股骨頭塌陷。
　　 目前髓芯減壓(core decompression CD)復(fù)合移植BMSCs治療早期ANFH的報道越來越多,多選擇抽取自體骨髓,簡單分離后獲取干細(xì)胞,直接注入壞死區(qū)。但該方法注入壞死區(qū)的BMSCs數(shù)量往往較少且附著能力差,影響了最終的治療效果。為了獲得更多BMSCs則需要使用異種血清在體外分離培養(yǎng),但是異種血清存在潛在抗原性、致

3、病性,限制了臨床推廣應(yīng)用。干細(xì)胞移植治療ANFH應(yīng)解決以下幾個關(guān)鍵問題:如何快速擴增培養(yǎng)自體間充質(zhì)干細(xì)胞、有效黏附并減少干細(xì)胞流失、避免異體或異種血清帶來的免疫反應(yīng)、客觀評價其臨床療效等。鑒于上述問題,我們采用自體血清擴增培養(yǎng)BMSCs,與人脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix DBM)復(fù)合移植,結(jié)合髓芯減壓治療早期ANFH,探討B(tài)MSCs移植治療早期ANFH的有效性與安全性。
　　 方法：
　　

4、 實驗分兩部分
　　 一、自體血清體外擴增培養(yǎng)BMSCs實驗研究
　　 1、自體血清體外擴增培養(yǎng)BMSCs
　　 1.1一般資料
　　 選取第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院收治的行BMSCs植入治療的早期ANFH患者10例,男9例、女1例,平均年齡36.2歲(19～45歲)。其中,激素性2例,酒精性3例,特發(fā)性5例。所有入組ANFH患者對本實驗均知情同意。
　　 1.2自體血清制備,BMSCs擴增培養(yǎng)及

5、鑒定
　　 由輸血科分次抽取200ml靜脈血,通過密度梯度離心制備獲取自體血清并冰凍保存?zhèn)溆?。由自體血清配置培養(yǎng)基并采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離篩選法進行BMSCs的體外擴增培養(yǎng),每日在倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化并做好專門的記錄。隨機抽取1名患者的P3細(xì)胞在流式細(xì)胞儀下行BMSCs表面標(biāo)志物鑒定。
　　 2、不同干擾因素對BMSCs增殖的影響
　　 2.1不同病因?qū)MSCs增殖的影響

6、
　　 按病因?qū)?0例患者分為3組:激素組(2例)、酒精組(3例)、特發(fā)性組(5例)。
　　 2.2血清濃度對BMSCs增殖的影響
　　 A組:10％胎牛血清組,B組:5％自體血清組,C組:10％自體血清組,D組:15％自體血清組,E組:20％自體血清組。
　　 2.3 BMSCs體外擴增培養(yǎng)方法
　　 對以上分組均采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離篩選法進行BMSCs的體外擴增和培養(yǎng)。
　　

7、 2.4比較觀察指標(biāo)
　　 每日在倒置相差顯微鏡下觀察每組細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化并做好專門記錄;分別計算傳代細(xì)胞倍增時間(population doubling time,PDT):PDT=(t-t0)log2/logN-logN0,其中,t-t0為給定培養(yǎng)期間;logN-logN0為給定培養(yǎng)期間增殖細(xì)胞數(shù)的對數(shù)差。
　　 2.5統(tǒng)計學(xué)方法
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組

8、間比較采用t檢驗,P值＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二自體血清培養(yǎng)BMSCs復(fù)合DBM移植結(jié)合髓芯減壓治療早期ANFH的初步臨床觀察
　　 1.一般資料
　　 8例雙側(cè)ANFH進入臨床治療,男7例、女1例,平均年齡35.7歲(19～43歲)。ARCO分期Ⅰ～Ⅲa期,按左右側(cè)隨機分為兩組:A組即單純股骨頭髓芯減壓組,B組即股骨頭髓芯減壓結(jié)合自體血清培養(yǎng)的BMSCs移植治療組。
　　 2.手術(shù)方法
　

9、　 股骨頭髓芯減壓:在C形臂X光機引導(dǎo)下從股骨粗隆下向股骨頭壞死區(qū)平行鉆入3個直徑5.0mm孔,至股骨頭軟骨下骨。
　　 BMSCs移植治療:將P3代BMSCs制成的細(xì)胞懸液與DBM復(fù)合;然后將BMSCs與DBM復(fù)合物充分充填于髓芯減壓孔內(nèi)。
　　 3.圍手術(shù)期處理
　　 由指定醫(yī)師對受試者圍手術(shù)期的各項診療、隨訪觀察和與受試者之間進行對其康復(fù)進程的長期動態(tài)交流,及時發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的問題,給予受試者有益的建議和幫

10、助。
　　 4.有效性與安全性評估
　　 術(shù)前、術(shù)后、3、6、12月進行嚴(yán)格的臨床隨訪,以后每6月隨訪一次,均進行Harris髖關(guān)節(jié)功能評分,VAS(visual analogue scale)疼痛評分、X線及MRI檢查,同時觀察血沉、C反應(yīng)蛋白、肝功、腎功、IgM、IgG、IgA等指標(biāo);將各項指標(biāo)通過t檢驗進行比較。
　　 5統(tǒng)計學(xué)方法
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表

11、示,組問比較采用t檢驗,P值＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn),患者知情同意后,簽署知情同意書。
　　 結(jié)果
　　 1.原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)多呈梭形,約10～12d可達到90％細(xì)胞融合,呈特征性的旋渦狀生長,排列有方向性。傳代細(xì)胞的生長較原代快,一般于接種后4-5d進入對數(shù)增殖期,到第6～8天即可達到90％;不同病因患者體外擴增三代后均可獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量;隨機抽取P3代BMSCs表面標(biāo)志

12、物鑒定,可見樣本細(xì)胞CD105呈陽性表達,CD34呈陰性表達。
　　 2.不同病因患者原代接種前獲得的骨髓單核細(xì)胞數(shù)量不同,酒精性、特發(fā)性的ANFH患者離心后獲得的單核細(xì)胞數(shù)量及擴增后獲得BMSCs數(shù)量多于激素性ANFH患者(P＜0.05);5％自體血清組和20％自體血清組均未完成原代和傳代培養(yǎng);相同病因10％胎牛血清組與10％自體血清組和15％自體血清組原代培養(yǎng)時間和傳代PDT比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);激素性的原代培養(yǎng)

13、時間和傳代PDT與酒精性和特發(fā)性相比較要長,比較有顯著差異(P＜0.05)。酒精性、特發(fā)性的原代培養(yǎng)時間和傳代PDT與比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.所有8例患者手術(shù)過程順利且均獲隨訪,隨訪時間12～42個月,平均23.5個月。術(shù)后3個月疼痛、跛行等臨床癥狀逐漸改善。術(shù)前及術(shù)后3、6個月兩組Harris評分及VAS評分組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),術(shù)后12個月B組評分高于A組(P＜0.05);術(shù)后各時

14、間點兩組Harris評分及VAS評分均較術(shù)前顯著提高(P＜0.05)。術(shù)后12個月X線及MRI檢查發(fā)現(xiàn)A組1例Ⅲa期患者出現(xiàn)股骨頭塌陷;B組術(shù)后12個月T1相低信號區(qū)所占股骨頭體積的百分比為相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);B組術(shù)后12個月T1加權(quán)像低信號區(qū)所占股骨頭體積的百分比縮小。
　　 4.安全性評估:所有患者術(shù)后均未出現(xiàn)不良反應(yīng);HIV、HCV、HTV抗體、乙肝病毒PCR在術(shù)前及術(shù)后具有嚴(yán)格的一致性;術(shù)前及術(shù)后肝腎

15、功、IgM、IgG、IgA均在正常范圍;CRP、C3、C4術(shù)后1周明顯升高,1個月恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論
　　 1.股骨頭缺血性壞死患者可以通過自體血清替代牛血清培養(yǎng),獲得高純度、活性強的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,至少在3代內(nèi)細(xì)胞生長旺盛且維持生物學(xué)特性;所獲得的細(xì)胞數(shù)量可以滿足臨床治療需要。
　　 2.酒精性、特發(fā)性ANFH患者BMSCs體外增殖能力較激素性ANFH患者強,酒精性和特發(fā)性相比較基本相似;10％胎牛血清組

16、與10％自體血清組和15％自體血清組體外增殖能力相似,10％較為適合作為ANFH患者BMSCs體外培養(yǎng)的自體血清濃度。
　　 3.髓芯減壓聯(lián)合利用體外擴增的BMSCs復(fù)合DBM移植治療早期ANFH,通過對臨床試用者各時間觀察點的功能評估,影像學(xué)評估、安全評估初步證實不僅療效滿意,而且具有較強的安全性。
　　 4.自體血清培養(yǎng)BMSCs移植結(jié)合髓芯減壓與單純髓芯減壓治療早期ANFH均有效,前者緩解疼痛及延緩塌陷方面優(yōu)于后者