SD大鼠視桿雙極細胞L-鈣通道電流特點.pdf

1、雙極細胞是脊椎動物視網膜的谷氨酸中間神經元，它接受光感受器細胞的信號輸入，在整合后傳遞至無長突細胞和神經節(jié)細胞。而在視網膜的信號傳遞中，雙極細胞的突觸前終末還受到無長突細胞的負反饋抑制，影響其對下一級神經節(jié)細胞的遞質分泌，因此雙極細胞在視網膜信號傳遞的過程處于一個關鍵的位置。雙極細胞通過其形態(tài)和生理方面的特征被分為視桿雙極細胞和視錐雙極細胞，其中大鼠視桿雙極細胞在形態(tài)上特征明顯，易于辨認，而視錐雙極細胞則形態(tài)多樣，目前根據形態(tài)學分為9種

2、類型。由于Ca2+流入細胞對于神經遞質出胞有重要作用，很多學者致力于神經元上Ca2+通道的特點，研究發(fā)現大鼠視網膜視桿雙極細胞釋放的神經遞質的基礎是L型Ca2+通道介導的Ca2+電流，因此L-Ca2+通道的功能失調則會影響視桿雙極細胞的神經傳導。
　　我實驗室在實驗中發(fā)現兩種自發(fā)性突變大鼠，分別為先天性靜止性夜盲（congenitalstationarynightblindnessCSNB）和視網膜錐體細胞失功能（retinalc

3、onedegenerationRCD）。目前已知前者的致病基因為cacna1f，該基因為一種L型鈣通道基因，該通道蛋白位于視桿細胞突觸后膜上，調節(jié)視桿細胞。通過調節(jié)細胞內Ca2+濃度而影響視桿細胞突觸遞質的釋放。探索相關的研究方法，了解正常大鼠L型Ca2+通道的性質,對于研究我們實驗室兩種模式動物的視網膜神經傳導通路特點有著重要的意義。為開展相關研究，本文先后采用了木瓜蛋白酶急性分解和視網膜鋪片后切片兩種方法進行視桿雙極細胞的鈣通道電流

4、的記錄。
　　材料與方法：
　　選取4-7周的SD大鼠。（1）使用木瓜蛋白酶急性分解的方法中，采用木瓜蛋白酶(papain，30,000USPu/mg，Calbiochem-Novabiochem)酶解獲得視桿雙極細胞，使用倒置顯微鏡、EPC10（Heka，Germany）及配套軟件Pulse8.6(Heka，Germany)來觀察細胞及膜片鉗記錄。（2）在使用視網膜鋪片后切片的方法中，使用手動切片機（ST-20,Naris

5、hige,Tokyo,Japan）迅速將視網膜切成150微米的薄片。然后使用EPC10（Heka，Germany）配套軟件Pulse8.6(Heka，Germany)來進行觀察細胞及膜片鉗記錄。
　　結果：
　　1．在木瓜蛋白酶急性分解的方法中，可以觀察到形態(tài)正常，數量較多的視桿雙極細胞。但是在記錄過程中，除一例細胞外，其余細胞均記錄不出L-Ca2+通道電流，但是可以正常記錄出GABA受體介導的電流。
　　2．在使用視

6、網膜鋪片后切片的方法中，可以觀察到清晰的視網膜神經細胞層次，辨別出視桿雙極細胞，并且在記錄過程中，在視桿雙極細胞的胞體成功記錄出L-Ca2+通道電流。在實驗中，慢電容補償（slowcapacitance）值為3.2±0.3pF（n=11）。階越（step）刺激:大小為31.1±3.3pA（n=11）。斜坡（ramp）刺激：大小為32.5±3.1pA（n=11）。
　　3．在得到穩(wěn)定的Ca2+電流之后，給予L-Ca2+通道阻斷劑ni

7、fedipine，濃度5μM，幾乎完全阻斷Ca2+電流。
　　結論：
　　1．木瓜蛋白酶急性分離的方法，未能記錄出L-Ca2+通道電流?？赡苡捎谝晽U雙極細胞軸突損傷，從而導致無法記錄出L-Ca2+通道電流。
　　2．視網膜鋪片后切片的方法，根據實驗得到的數據，得到的電流，其電流的大小和性質符合L-Ca2+通道電流的特點。通過相關藥物可阻斷視桿雙極細胞L-Ca2+通道的信號傳導。在本次實驗中使用nifedipine，可以