致腎盂腎炎大腸桿菌132菌株消減文庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、目的： 構(gòu)建國內(nèi)分離的致腎盂腎炎大腸桿菌(uropathogenic E.coli,UPEC)132基因組DNA消減文庫，篩選其特異性片段，并對(duì)新發(fā)現(xiàn)的片段獲取其完整的開放讀碼框(open reading frame,ORF)。 方法： 1．以UPEC132為tester(待富集特有序列的菌株)，以完成基因組測序的非致病性E．coli K-12 MG1655為driver(扣除tester中共有序列的菌株)，應(yīng)用

2、抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)，經(jīng)過兩輪消減雜交和兩次抑制性PCR，選取UPECl32基因組的差異片段，進(jìn)行T-A克隆，轉(zhuǎn)化給E.coli Top10，在氨芐青霉素(Amp)及X-gal/IPTG篩選下，挑取白色陽性重組子，獲得UPEC132基因組DNA消減文庫。 2．從上述DNA消減文庫中隨機(jī)挑選陽性重組子，經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA作為模板，經(jīng)PCR篩選驗(yàn)

3、證。將上述PCR產(chǎn)物變性后點(diǎn)于尼龍膜上，地高辛隨機(jī)引物法分別標(biāo)記UPECl32和E．coli K-12 MGl655基因組DNA作為探針，經(jīng)過預(yù)雜交、雜交、DAB顯色，篩選帶有UPEC132特異性片段的陽性克隆子。挑選有意義的克隆株進(jìn)行序列分析，所得序列結(jié)果輸入GenBank，利用BLAST程序(http://www/ncbi.nlm.gov/BLASTN)查找NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行相似性比對(duì)。 3．選取新發(fā)現(xiàn)的片段，用基因組步移

4、(Genome Walker)方法獲得其5’端和3’端的序列。首先提取UPEC132基因組DNA，將其分為4組，分別用DraⅠ、EcoRV、StuⅠ、PvUⅡ酶切，然后與Genome Walker接頭(adaptor)連接，建立Genome Walker文庫。分別以4組Genome Walker文庫基因組DNA片段為模板，以接頭特異性引物和新發(fā)現(xiàn)片段的特異性引物進(jìn)行第一次LD-PCR和第二次巢式PCR，將第二次PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行T-A克

5、隆，轉(zhuǎn)化給E.coli Top10，其結(jié)果用Proscan(Version 1.7)軟件分析，確定新發(fā)現(xiàn)片段的完整ORF。 結(jié)果： 1．應(yīng)用抑制性消減雜交獲得約1600個(gè)重組子的UPEC132基因組DNA消減文庫。 2. 隨機(jī)挑取其中的350個(gè)克隆，經(jīng)PCR和斑點(diǎn)雜交篩選，挑選93個(gè)克隆測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示：1個(gè)UPEC132特異性SSH片段R049(789bp)與GenBank注冊(cè)的UPEC菌株相關(guān)序列無

6、相似性；39個(gè)UPEC132特異性SSH片段與GenBank注冊(cè)的UPEC132菌株相關(guān)序列顯示高度的相似性，其中10個(gè)為與致病相關(guān)基因序列，8個(gè)為與代謝與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因序列，2個(gè)為與外膜蛋白有關(guān)基因序列，3個(gè)為與調(diào)節(jié)相關(guān)基因序列，還有11個(gè)為未知功能蛋白的基因和5個(gè)其它功能未分類的基因序列。另有19個(gè)UPEC132特異性SSH片段與GenBank注冊(cè)的非UPEC菌株相關(guān)序列顯示高度的相似性，其中13個(gè)與其他大腸桿菌tRNA或質(zhì)粒序列

7、相關(guān)，其他6個(gè)與沙門氏菌或志賀氏菌等的序列相關(guān)。此外，有10個(gè)SSH片段重復(fù)出現(xiàn)，6個(gè)片段為使用的克隆載體(pMD-18T載體)的序列。所獲得的UPEC132特異性SSH片段均未發(fā)現(xiàn)與E．coli K-12 MG1655相關(guān)的序列，表明我們獲得的UPEC132基因組消減文庫是成功的。將新發(fā)現(xiàn)的UPEC132片段，命名為R049(789bp)，提交GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為EF488001。 3．以R049(789bp)為核心，

8、用基因組步移技術(shù)雙向延伸，獲得R049(789bp)5’端1502 bp和3’端1207 bp。利用DNAStar 5.01軟件進(jìn)行序列拼接，共獲得3498bp的片段，進(jìn)一步利用Proscan(Version 1.7)軟件分析，獲得一個(gè)1311bp的可能的ORF，暫命名為R049(1311bp)。 結(jié)論： 本研究已成功地構(gòu)建了UPEC132菌株基因組DNA消減文庫，并獲取了UPEC132的特異性片段，為致腎盂腎炎大腸桿菌