肝螺桿菌甲基基團(tuán)接受趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白多克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、目的和意義
　　 肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus,Hh)致病機(jī)制及流行病學(xué)特征尚不完全清楚。本研究通過(guò)制備肝螺桿菌甲基基團(tuán)接受趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(methyl-acceptingchemotaxis signal transduction protein,MCP)兔抗血清,為進(jìn)一步探討肝螺桿菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人類(lèi)的感染及及臨床檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料和方法
　　 1、主要材料:

2、細(xì)菌菌株(肝螺桿菌、幽門(mén)螺桿菌),空腸彎曲菌瓊脂基礎(chǔ),弗氏完全/不完全佐劑,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG。Balb/C小鼠,新西蘭大白兔。
　　 2、方法
　　 2.1細(xì)菌分離及培養(yǎng)
　　 2.1.1膽型螺桿菌的分離及鑒定
　　 參照文獻(xiàn)[1]方法分離膽型螺桿菌。SPF(special pathogene free)級(jí)Balb/C小鼠禁食48h后,取腸道組織勻漿,涂布于空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基(含

3、7％凍融脫纖維羊血,選擇性抗生素萬(wàn)古霉素10mg/L,多粘菌素B 2500單位/L,二性霉素B 10mg/L,TMP 5mg/L),37℃微需氧條件(5％O2,10％CO2及85％N2)下培養(yǎng)3-5天,每天觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。挑取可疑菌落傳代培養(yǎng)。
　　 細(xì)菌鑒定:1、形態(tài)鑒定可疑細(xì)菌涂片革蘭染色,油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。2、生化鑒定 可疑細(xì)菌行快速尿素酶、氧化酶、過(guò)氧化物酶及硝酸還原酶實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)試劑盒由環(huán)凱生化公司提供)3、PCR擴(kuò)

4、增細(xì)菌16srRNA基因?qū)⑼该鳌⑨樇獯笮〉木溆妹藓灩沃罞P管中,PBS沖洗三次后,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。以可疑菌基因組DNA為模板,采用螺桿菌屬特異性引物行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃10min總變性,94℃ 30s,54℃ 30s,72℃ 55s,共35個(gè)循環(huán),72℃10min總延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳,電泳條件80V,30min。陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序分析(測(cè)序工作由英俊生物公司完成)。
　　

5、2.1.2細(xì)菌傳代培養(yǎng)
　　 取肝螺桿菌、膽型螺桿菌、幽門(mén)螺桿菌保種液各100μl涂布于空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基,37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天,細(xì)菌涂片革蘭染色觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。
　　 2.2提取細(xì)菌外膜蛋白(cell surface proteins,CSPs)
　　 細(xì)菌在空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同前)48-72h后,用滅菌雙蒸水洗刮下菌苔,室溫4000 r/min,20 min離心洗滌菌

6、液。重復(fù)洗滌一次。棄上清,收集菌泥,稱(chēng)重,按每4 g菌泥加入0.2mol/L、pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液100 ml,4℃磁力攪拌30 min,后在4℃條件下12000 r/min,離心15 min。透析,冷凍干燥法濃縮。BCA法測(cè)蛋白濃度。
　　 2.3 MCP基因在大腸桿菌中的表達(dá)
　　 將我室保種的重組質(zhì)粒pET22b+/MCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3),挑單克隆接種于10ml含氨芐青霉素100μg/

7、ml的LB培養(yǎng)基,37℃200rpm培養(yǎng)3個(gè)半小時(shí)至OD600約為0.6-1.0。轉(zhuǎn)接100μl于10ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中,37℃200rpm培養(yǎng)1.5小時(shí)至OD600約為0.6,加入500mmol/L IPTG至終濃度為1mmol/L,37℃180rpm震蕩培養(yǎng)4小時(shí)。將誘導(dǎo)菌液12000rpm 4℃離心5min,取1ml菌液沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。重組蛋白rhMCP包含表達(dá)載體pET22b(+)中的6

8、×His標(biāo)簽,因此用Western blot對(duì)rhMCP的表達(dá)再次進(jìn)行鑒定。
　　 2.4 rhMCP蛋白的純化
　　 取1000ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液,12000rpm 4℃離心5min,菌體沉淀加入1/20細(xì)菌生長(zhǎng)體積的細(xì)菌裂解液和PMSF,冰上超聲破碎細(xì)菌,10000rpm 4℃離心15min。棄上清,往沉淀中加入1/20細(xì)菌生長(zhǎng)體積的UrNTA-0 Buffer和PMSF,將細(xì)胞懸浮,室溫放置30min,10000r

9、pm 4℃離心15min,取上清。用30ml的UrNTA-0 Buffer平衡3ml NTA層析柱,上清液上柱,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。15ml UrNTA-0 Buffer洗脫未結(jié)合部分,然后分別用15mlUrNTA-20,UrNTA-40,UrNTA-60,UrNTA-100,UrNTA-200,UrNTA-500洗脫,收集洗脫液,用SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。用梯度PBS-尿

10、素4℃透析(6M-4M-2M-1M),每4小時(shí)換液一次,最后用PBS 4℃透析24小時(shí)。BCA法測(cè)蛋白濃度,-70℃保存。
　　 2.5兔抗重組融合蛋白MCP抗血清的制各
　　 取MCP重組蛋白800μl(約800μg)與800μl弗氏完全佐劑徹底乳化,經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔。首次免疫后4周取純化的融合蛋白MCP 400 μl(約400μg)與400μl弗氏不完全佐劑徹底乳化,進(jìn)行第2次免疫,之后第6,8周分別用M

11、CP加上等體積弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫,最后一次免疫不加佐劑。最后1次加強(qiáng)免疫后5-7天耳緣靜脈采血2mL,行Western blot檢測(cè)血清中是否有特異性抗體,并用間接ELISA法測(cè)定血清中抗體的效價(jià)。檢測(cè)到特異性抗體后頸動(dòng)脈插管放血,分離血清,置-80℃保存。
　　 2.6 ELISA法測(cè)定效價(jià)
　　 純化的融合蛋白MCP按5μg/ml,50μl/孔,包被酶標(biāo)板,分別加人不同倍數(shù)稀釋的血清,PBST沖洗后加HRP標(biāo)記的

12、羊抗兔IgG二抗孵育,最后加TMB底物液顯色,終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm,以等于陰性對(duì)照孔的2.1倍者判為陽(yáng)性。
　　 2.7兔抗融合蛋白MCP抗體的純化
　　 2.7.1飽和硫酸銨法初純抗體
　　 往10ml免疫兔血清中加等量的PBS(pH7.4):逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液,于4℃靜置30 min; 4℃ 2000 rpm/min離心15 min；棄上清,沉淀用20 ml預(yù)冷的PBS溶解,逐滴加入10m

13、L飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30min；2000rpm離心15 min,收集沉淀,沉淀用20ml預(yù)冷的PBS溶解,獲得初步純化的IgG抗體溶液。
　　 2.7.2抗原特異性純化法純化抗體
　　 先用PH8.3的碳酸鹽緩沖液預(yù)平衡CNBr-activated Sepharose 4B層析柱,加入純化的MCP蛋白5mg,4℃過(guò)夜。次日離心去除未結(jié)合的蛋白,封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)后加入粗純抗體5mL于4℃搖床過(guò)夜。向柱中加入洗脫液

14、離心后,吸取上清即為能與重組蛋白MCP特異結(jié)合的兔抗MCP抗體。加入等體積的甘油及疊氮鈉至終濃度0.02％,分裝后-70℃保存。
　　 2.8兔抗MCP抗體的特性鑒定
　　 Western blot檢測(cè)抗體特異性取MCP重組蛋白、肝螺桿菌、幽門(mén)螺桿菌、及膽型螺桿菌菌體外膜蛋白CSPs變性后行SDS-PAG凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以封閉液(50 mmol/L Tris-Buffered-Saline,pH7.5,含1

15、％BSA和0.1％Tween20)于37℃振蕩封閉2h,再加入以封閉液稀釋(1:500)的兔抗MCP純化抗體,于4℃孵育過(guò)夜,洗膜后加1:5000稀釋的HRP-羊抗兔IgG(武漢博士德公司產(chǎn)品)于37℃溫育1 h,充分洗滌后ECL發(fā)光,顯影。
　　 結(jié)論
　　 本研究中成功從Balb/c小鼠結(jié)腸中分離出膽型螺桿菌。利用分離純化后的重組蛋白MCP免疫新西蘭大白兔,成功獲得抗MCP的多克隆抗體血清,該抗體特異性強(qiáng),純化后用W