組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其動(dòng)物移植試驗(yàn).pdf

1、人角膜內(nèi)皮層(HCE)由單層的六角形人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(HCE細(xì)胞)鑲嵌而成,是前房房水和角膜基質(zhì)之間的滲漏性屏障,HCE細(xì)胞質(zhì)膜上所擁有的諸多膜運(yùn)輸?shù)鞍淄ㄟ^發(fā)揮“泵”功能使整個(gè)角膜處于半脫水狀態(tài),在維持角膜正常厚度和其透明性進(jìn)而保障眼睛發(fā)揮正常視功能方面具有不可替代的作用。遺憾的是,成人的HCE細(xì)胞喪失了增殖能力,而且數(shù)量還在逐年減少,HCE單層完整性的維持只能靠鄰近HCE細(xì)胞的擴(kuò)大和移行來實(shí)現(xiàn)。一旦受到病原體感染、機(jī)械損傷和非生理性脅迫

2、等,HCE細(xì)胞死亡的速率更快,輕者會(huì)造成不可逆角膜病變——角膜內(nèi)皮功能失代償(corneal endothelial dysfunction),重者將會(huì)致盲——角膜內(nèi)皮盲(primary corneal endotheliopathy),角膜內(nèi)皮病盲在因角膜病變所導(dǎo)致的視力障礙中位于第二位。角膜移植是目前治療角膜內(nèi)皮病盲的唯一辦法,因HCE異常僅僅是由于HCE細(xì)胞數(shù)量不足造成的,故絕大多數(shù)角膜內(nèi)皮病盲患者均可通過角膜移植而治愈,但由于捐

3、獻(xiàn)角膜數(shù)量的高度匱乏,致使可用于角膜移植的供體角膜材料嚴(yán)重不足,眾多角膜內(nèi)皮病盲患者無法通過角膜移植重見光明。
　　目前,組織工程人角膜內(nèi)皮(tissue-engineered human corneal endothelium, TE-HCE)被公認(rèn)為是治療角膜內(nèi)皮病盲的天然HCE的等效替代物,已成為廣大角膜內(nèi)皮病盲患者恢復(fù)視力和復(fù)明的唯一希望。但迄今為止,仍沒有可用于臨床HCE移植的TE-HCE產(chǎn)品問世。本文在前期研究工作的基

4、礎(chǔ)上,利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒有致瘤性的人角膜內(nèi)皮單克隆細(xì)胞株細(xì)胞(monoclonal human corneal endothelial cells, mcHCE細(xì)胞)為種子細(xì)胞,以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮層修飾羊膜( modified denuded-epithelium amniotic membrane, mdAM)為載體支架,在體外重建出了形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)正常的TE-HCE,并利用家貓和獼

5、猴進(jìn)行了動(dòng)物角膜的穿透性后板層角膜移植試驗(yàn),旨在獲得可使移植動(dòng)物角膜長期維持透明的TE-HCE,為可用于臨床HCE移植的TE-HCE新產(chǎn)品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　用于 TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞為來自非轉(zhuǎn)染無致瘤性 HCE細(xì)胞系(utHCEC01)的第38代mcHCE細(xì)胞。在用作種子細(xì)胞開展TE-HCE體外重建之前,分別對其細(xì)胞屬性、功能蛋白的表達(dá)以及致瘤性進(jìn)行了檢測和鑒定。檢測結(jié)果顯示,第38代mcHCE細(xì)胞呈近似六

6、角形的多邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài),透明度高,形態(tài)大小均一,細(xì)胞群體倍增時(shí)間為41.07 h,染色體數(shù)目為2n=46條,表明該細(xì)胞株細(xì)胞的生長狀態(tài)良好,分裂增殖能力旺盛;第38代 mcHCE細(xì)胞仍維持有標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長因子受體-2(Flk1)和人 IV型膠原蛋白的陽性表達(dá),表明該細(xì)胞株細(xì)胞保持有HCE細(xì)胞的固有屬性;細(xì)胞連接蛋白的免疫熒光檢測結(jié)果顯示,第38代mcHCE細(xì)胞仍保持有緊密連接蛋白1(ZO-1)、N-鈣粘蛋白(N-Cadh

7、erin)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5(Integrinαv/β5)的陽性表達(dá),表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有在細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間形成細(xì)胞連接的潛能;第38代 mcHCE細(xì)胞還維持有細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)鞍住薔a+/K+ATPase、人氯離子通道蛋白-2( hCLCN2)、Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hSLC4)和人水孔通道蛋白-1(AQP1)的陽性表達(dá),表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有發(fā)揮正常膜運(yùn)輸功能的潛能;第38代mc

8、HCE細(xì)胞在裸鼠皮下接種后沒有腫瘤出現(xiàn),證實(shí)該細(xì)胞株細(xì)胞沒有致瘤性。綜合上述檢測和鑒定結(jié)果,證明第38代mcHCE細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能正常,且沒有致瘤性,可以被用作 TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞。
　　本文利用胰酶-EDTA倒置消化法對去上皮層羊膜進(jìn)行薄化處理,再使用專用信號分子包被,制得薄化 mdAM。在用作載體支架進(jìn)行 TE-HCE體外重建之前,分別對其進(jìn)行理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及其與第38代 mcHCE細(xì)胞的生物相容性

9、進(jìn)行檢測和評價(jià)。結(jié)果顯示,薄化 mdAM只有基底膜和致密層組成,且上皮面光滑平整;厚度均一,平均厚度約為28.47μm;透明度和透光率良好,可見光區(qū)的透光率在90％以上;重金屬含量符合國家對可吸收植入型醫(yī)用生物材料的要求。薄化 mdAM無熱源和眼刺激性;皮下植入后無炎癥反應(yīng)且降解速度比瑞濟(jì)生物羊膜快;且與第38代mcHCE細(xì)胞具有良好的生物相容性。綜上所述,薄化 mdAM具有良好的理化和生物學(xué)性能,安全性高,且與 mcHCE細(xì)胞生物相容

10、性良好,可以被用作TE-HCE體外重建的載體支架。
　　本文以上述mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞、以薄化mdAM為載體支架,用含20%FBS的 DMEM/F12(1:1)完全培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行了TE-HCE的體外重建。每24 h茜素紅染色結(jié)果顯示,重建96 h后種子細(xì)胞便可在載體支架上形成完整連續(xù)的細(xì)胞層,細(xì)胞與細(xì)胞間著色清晰,細(xì)胞呈近似六角形內(nèi)皮樣形態(tài),細(xì)胞密度為3487±99.04個(gè)/mm2;組織結(jié)構(gòu)和超微

11、結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示,體外重建96 h所得的TE-HCE具有完整連續(xù)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞單層,多角形細(xì)胞中具有一定數(shù)量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與載體支架間具有多處細(xì)胞連接樣結(jié)構(gòu),與正常HCE的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)相似。免疫熒光檢測結(jié)果顯示,體外重建96 h所得的TE-HCE仍維持有細(xì)胞緊密連接蛋白1(ZO-1)、N-鈣粘蛋白(N-Cadherin)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5(Integrinαv/β5)的陽性

12、表達(dá),表明體外重建96 h所得的TE-HCE具有形成緊密連接復(fù)合體進(jìn)而形成前房房水與角膜基質(zhì)間滲漏性屏障的潛能。綜上所述,體外重建96 h所得TE-HCE具有與正常HCE相似的形態(tài)特征、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu),可以作為正常HCE的等效替代物,被認(rèn)為可以用于角膜內(nèi)皮病盲的臨床治療。
　　為了進(jìn)一步評價(jià)所重建的TE-HCE在體內(nèi)是否具有正常HCE的生理功能。本文選用自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞沒有增殖能力的家貓和獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。首先撕除實(shí)驗(yàn)眼的后彈

13、力層和內(nèi)皮層,然后進(jìn)行帶DiI熒光標(biāo)記的TE-HCE和mdAM(對照組)的后板層角膜移植。移植后用裂隙燈顯微鏡、角膜測厚儀和眼壓計(jì)跟蹤觀察其透明度、厚度和眼壓的變化情況,并在家貓移植104天,獼猴移植181天時(shí)取材進(jìn)行DiI熒光標(biāo)記、茜素紅染色及細(xì)胞密度、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的離體鑒定,此外家貓還進(jìn)行了房水蛋白變化的鑒定。結(jié)果顯示,家貓和獼猴 TE-HCE移植眼的角膜均未出現(xiàn)水腫和排斥等不良反應(yīng),角膜厚度逐漸下降,并逐漸恢復(fù)透明;而mdA

14、M實(shí)驗(yàn)眼,角膜水腫嚴(yán)重且不透明;但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常對照眼的眼壓在觀察期間均在上下波動(dòng),沒有明顯的相關(guān)性。離體檢測結(jié)果顯示,家貓和獼猴 TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均帶有DiI熒光標(biāo)記,且形態(tài)大小均一,多為六角形鑲嵌內(nèi)皮樣形態(tài),細(xì)胞密度分別為2573.33±0.59個(gè)/mm2和2780.00±0.77個(gè)/mm2,與他們各自正常對照眼的形態(tài)和細(xì)胞密度相近,而 mdAM移植眼角膜中央移植區(qū)均沒有內(nèi)皮細(xì)胞,

15、這表明,家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均來自所植入的TE-HCE,且具有與正常對照眼相似的形態(tài)特征和細(xì)胞密度。家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)與正常對照眼角膜相似,但獼猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE細(xì)胞仍沒有分泌形成新的后彈力層。家貓TE-HCE移植眼和正常對照眼房水蛋白的二維電泳的分析結(jié)果顯示,TE-HCE移植眼與正常對照眼房水蛋白分離斑點(diǎn)的重復(fù)性較好,匹配的 Corr系數(shù)達(dá)到

16、0.8以上。綜上所述, TE-HCE在家貓和獼猴體內(nèi)具有正常 HCE的生理功能,能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度和長期透明性。
　　綜上所述,利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒有致瘤性的mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞,以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化 mdAM為載體支架,在體外重建96 h后即可獲得形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu)近似正常 HCE的TE-HCE,且移植到自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞無增殖能力且撕除后彈力層和內(nèi)皮層的家貓和獼猴角