基于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織工程全層人角膜的體外重建、鑒定及其在動(dòng)物移植中的作用研究.pdf

1、角膜是位于眼表的透明組織,主要行使屈光的功能。由于角膜直接與外界環(huán)境接觸,因此極易受到機(jī)械外傷、熱灼傷以及微生物的感染,導(dǎo)致角膜病的發(fā)生,嚴(yán)重者甚至失明。角膜移植是唯一的治療方法。但是,目前所需的供體角膜數(shù)量嚴(yán)重匱乏,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。隨著角膜組織工程的興起與發(fā)展,組織工程人角膜(Tissue-engineered Human Cornea,TE-HC)有望成為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物,從而解決供體不足的問(wèn)題,為角膜病盲患者帶來(lái)復(fù)明的

2、希望。TE-HC體外重建的核心要素主要包括兩方面:一是能夠獲得足量的、形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能正常的人角膜種子細(xì)胞;二是制備出與種子細(xì)胞具有良好生物相容性的載體支架。目前用于TE-HC的種子細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)、原代培養(yǎng)細(xì)胞、成體干細(xì)胞(adult stem cells, ASC)以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞; ESC應(yīng)用引起的倫理問(wèn)題、原代培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量限制、ASC誘導(dǎo)分化率低以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞的潛在致瘤

3、性風(fēng)險(xiǎn),限制了這些細(xì)胞在角膜組織工程中的應(yīng)用;載體支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料構(gòu)建的載體支架存在的機(jī)械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性較差限制了其作為組織工程角膜載體支架的應(yīng)用。因此尋找理想的角膜種子細(xì)胞以及載體支架材料成為體外成功重建TE-HC的關(guān)鍵因素。
　　本文采用的非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的 HCEP(human corneal epithelium, HCEP)細(xì)胞、基質(zhì)(huma

4、n corneal stroma, HCS)細(xì)胞以及內(nèi)皮(human corneal endothelium, HCE)細(xì)胞,具有角膜細(xì)胞的正常屬性及功能,并且體外增殖能力強(qiáng),短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的細(xì)胞,從而作為理想的種子細(xì)胞解決了TE-HC體外重建的種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。而在載體支架方面,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究、探索及優(yōu)化,制備出了具有透光率高、生物相容性好的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal stroma

5、, aPCS),成為體外重建TE-HC的理想載體支架材料。
　　為了進(jìn)一步鑒定HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的屬性、功能蛋白的表達(dá)以及是否具有潛在的致瘤性,本文對(duì)第70代的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示,復(fù)蘇的第70代HCEP細(xì)胞和HCE細(xì)胞均呈典型上皮細(xì)胞型,而HCS細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞型。HCEP細(xì)胞、HCE細(xì)胞的細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密相靠、互相銜接,排列呈現(xiàn)“鋪路石”狀,具有連

6、接成片的能力,而 HCS細(xì)胞排列呈流線型。HCEP細(xì)胞、HCE細(xì)胞以及HCS細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為39.6 h、38.6 h和36.5 h,三種細(xì)胞的活力良好,增殖分裂旺盛,特征性染色體數(shù)目仍均為2n=46。功能蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,HCEP細(xì)胞能夠表達(dá)HCEP特異性標(biāo)志蛋白---角蛋白3和12,以及鈉鉀泵和整聯(lián)蛋白,表明該細(xì)胞仍具有角膜上皮的表型,且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能;HCS細(xì)胞能夠表達(dá)HCS特異性標(biāo)志蛋白---波形蛋

7、白,以及乙醛酸脫氫酶 ALDH3A1及整聯(lián)蛋白,表明該細(xì)胞仍具有角膜基質(zhì)細(xì)胞的潛能;而HCE細(xì)胞能夠表達(dá)鈉鉀泵、緊密連接蛋白 ZO-1及整聯(lián)蛋白,表明該細(xì)胞仍具有角膜內(nèi)皮的表型,且具有形成完整HCE結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,這三種角膜種子細(xì)胞安全性好,均無(wú)致瘤性。因此,HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞可作為體外重建TE-HC的理想種子細(xì)胞。
　　為了獲得理想的載體支架,本文以帶后彈力層的豬角膜為研究材料,應(yīng)用0.5％脫

8、氧膽酸鈉及0.04%原釩酸鈉聯(lián)合 DNA-RNA酶對(duì)豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理,通過(guò)風(fēng)干的方法制備出理想的 aPCS載體支架材料,并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)功能鑒定和生物相容性研究。石蠟切片HE染色和冰凍切片DAPI染色結(jié)果顯示,aPCS無(wú)任何細(xì)胞殘留;阿利新蘭染色結(jié)果顯示胞外基質(zhì)糖胺聚糖(GAG)的分布與對(duì)照相似;而掃描電鏡結(jié)果顯示aPCS后彈力層面及基質(zhì)面光滑平整;透射電鏡結(jié)果顯示構(gòu)成aPCS膠原板層的膠原纖維排列整齊規(guī)則。為了檢測(cè)aPCS的生物相

9、容性,我們制備了aPCS浸提液,并進(jìn)行了浸提液對(duì)HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的細(xì)胞活力及細(xì)胞毒性的檢測(cè),結(jié)果顯示aPCS浸提液對(duì)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)影響,不影響細(xì)胞的增殖,也不引起細(xì)胞的凋亡,沒(méi)有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此,aPCS可以作為體外重建TE-HC的理想載體支架。
　　為了建立TE-HC體外規(guī)?；亟ǖ募夹g(shù)工藝條件,在獲得了理想的種子細(xì)胞和載體支架材料后,我們進(jìn)行了TE-HC的體外重建研究。首先采用微量注射的方法將 H

10、CS細(xì)胞接種于 aPCS支架的基質(zhì)中,然后將其置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24 h;其次,將接種過(guò)HCS細(xì)胞的植片放于插入式培養(yǎng)皿中,后彈力層面朝上,將 HCE細(xì)胞接種于aPCS的后彈力層面,培養(yǎng)24 h后反轉(zhuǎn)植片,后彈力層朝下,接種HCEP細(xì)胞,采用氣-液界面培養(yǎng)方法持續(xù)培養(yǎng)5 d,從而重建出了TE-HC,并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能蛋白表達(dá)進(jìn)行了鑒定。茜

11、素紅染色結(jié)果顯示HCE細(xì)胞在后彈力層面形成了連續(xù)的細(xì)胞單層;石蠟切片HE染色結(jié)果顯示aPCS支架內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞伸展良好,與支架材料結(jié)合緊密;而HCEP細(xì)胞在aPCS支架基質(zhì)層表面形成了6-7層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu),類似于正常角膜的結(jié)構(gòu);免疫組化染色結(jié)果顯示TE-HC的 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白、功能蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性,與正常細(xì)胞的表型和功能相同。上述結(jié)果表明以帶后彈力層的 aPCS為載體支架、以第70代 HCEP細(xì)胞、HC

12、S細(xì)胞以及HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞體外成功重建出了TE-HC,具有與活體角膜相似的組織結(jié)構(gòu),其種子細(xì)胞具有功能蛋白的陽(yáng)性表達(dá),表明可能具有全角膜的生物學(xué)功能。
　　為了鑒定體外重建 TE-HC的生物學(xué)功能,本文選用新西蘭兔和比格犬進(jìn)行了TE-HC的穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn),并通過(guò)過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察、角膜厚度以及眼壓測(cè)定等方法來(lái)評(píng)估在體TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。結(jié)果顯示,新西蘭兔術(shù)后前10 d,角膜水腫,眼壓偏高;第20 d,

13、水腫狀況減輕,眼壓恢復(fù)正常;第30 d,角膜部分透明。比格犬移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在術(shù)后前期,植片水腫,眼壓升高,但是30 d后,角膜重新上皮化,眼壓恢復(fù)正常,角膜水腫減輕,但是還是未恢復(fù)到正常角膜厚度,目前我們已觀察至270 d,發(fā)現(xiàn)角膜新生血管情況好轉(zhuǎn),但是術(shù)眼角膜厚度還是高于正常角膜。
　　綜上所述,本文以具有正常屬性和功能的第70代HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞,以具有良好生物相容性的 aPCS為載體支架,體