低劑量節(jié)拍化療對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3血管生成擬態(tài)的影響及其機(jī)制的探討.pdf

1、目的:血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是高侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞所具有的自我血供的微循環(huán)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)荷人卵巢上皮性癌SKOV3細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型行不同模式的順鉑(DDP)化療獲取移植瘤原代細(xì)胞，比較接受低劑量節(jié)拍化療(low-dose metronomicchemotherapy，LDM)和最大可耐受劑量化療(maximum tolerated dosechemotherapy，MTD)后SKOV3移

2、植瘤原代細(xì)胞形成VM的能力、增殖力及侵襲力，同時(shí)分析不同化療模式對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、ALDH1蛋白表達(dá)的影響，并比較CD133+ALDH1+和CD133-ALDH1-細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的差異，以探討不同模式化療對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞形成VM的影響及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、建立裸鼠移植瘤模型并分組化療:體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，將1×107個(gè)細(xì)胞接種于雌性裸鼠右側(cè)的大腿皮下，建立裸鼠異種移植瘤模型。2周后選取3

3、0只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成三組:LDM組給予DDP1mg/kg腹腔注射，每日1次，共18次;MTD組給予DDP3mg/kg腹腔注射，每3日1次，共6次;對(duì)照組給與等量生理鹽水腹腔注射，每日1次，共18次。
　　2、制備并培養(yǎng)腫瘤原代細(xì)胞:化療結(jié)束后3-7天分批處死裸鼠，剝出腫瘤經(jīng)膠原酶消化、研磨、過(guò)濾、離心、洗滌，制得單細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)72小時(shí)后獲得腫瘤原代細(xì)胞。
　　3、三維細(xì)胞培養(yǎng)(three-dimensional cel

4、l culture，3DCC)觀察比較細(xì)胞形成VM的能力:將三組原代細(xì)胞的單細(xì)胞懸液調(diào)整密度至5×104個(gè)/ml，接種到3DCC模型，利用倒置顯微鏡連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察VM開(kāi)始形成的時(shí)間和最終形成密度，并計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)密度(vasculogenic mimicrydensity，VMD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并拍照記錄。
　　4、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組原代細(xì)胞的增殖能力。
　　5、利用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組原代細(xì)胞的侵襲力。

5、
　　6、采用Westernblot法檢測(cè)三組原代細(xì)胞中CD133、ALDH1蛋白的表達(dá)情況。
　　7、流式細(xì)胞分選(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分選細(xì)胞:培養(yǎng)MTD組原代細(xì)胞至足夠數(shù)量，使用CD133、ALDH1抗體依次標(biāo)記原代細(xì)胞，采用FACS分離獲得兩群細(xì)胞:熒光表達(dá)較強(qiáng)的細(xì)胞群為CD133+ALDH1+細(xì)胞，熒光表達(dá)較弱的細(xì)胞群為CD133-ALDH1-細(xì)胞。

6、r>　　8、3DCC觀察比較形成VM的差異:將分選得到的CD133+ALDH1+細(xì)胞以5×104個(gè)/ml的密度，CD133ALDH1-細(xì)胞以5×104個(gè)/ml和1×105個(gè)/ml的密度，分別接種到3DCC模型培養(yǎng)并觀察比較其形成VM的不同。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)多重比較采用S-N-K法;方差不齊時(shí)采用Dunnett's

7、T3法。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、LDM較MTD模式化療更明顯的抑制SKOV3原代細(xì)胞在3DCC模型中VM的形成。
　　3DCC比較三組原代細(xì)胞形成VM能力，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察形成VM情況，記錄最初形成VM的時(shí)間:MTD組6小時(shí)，對(duì)照組9小時(shí)，LDM組12小時(shí);接種后48小時(shí)形成VM數(shù)量不再變化，計(jì)數(shù)VMD:MTD組27.60±9.

8、55個(gè)/視野，對(duì)照組18.67±4.97個(gè)/視野，LDM組11.20±2.59個(gè)/視野，三組的VMD差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.761; P=0.000)。
　　2、LDM較MTD模式化療可明顯抑制SKOV3原代細(xì)胞的增殖能力。
　　MTT檢測(cè)不同化療模式對(duì)原代細(xì)胞增殖的影響。MTT生長(zhǎng)曲線表明從第3天開(kāi)始MTD組高于對(duì)照組和LDM組(F=5.738;P=0.018);S-N-K多重比較結(jié)果顯示:對(duì)照組和LDM組至第5天增

9、殖差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.853)。
　　3、MTD模式化療提升原代細(xì)胞侵襲力，LDM模式化療則降低其侵襲力。
　　Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:MTD組細(xì)胞穿膜數(shù)為（156.93±22.77），對(duì)照組為（112.13±16.59），LDM組為（87.33±19.58），三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.570;P=0.000)。
　　4、MTD模式化療可使SKOV3原代細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133

10、、ALDH1蛋白的表達(dá)水平上升。
　　Westernblot檢測(cè)結(jié)果提示:三組間CD133蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.251;P=0.006)，S-N-K多重比較結(jié)果表明對(duì)照組和LDM組之間總體均數(shù)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.137);三組間ALDH1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.323;P=0.000)，對(duì)照組和LDM組之間總體均數(shù)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.517)。
　　5、FCAS結(jié)果
　　

11、因Westernblot結(jié)果提示MTD組CD133、ALDH1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和LDM組顯著升高，故培養(yǎng)MTD組細(xì)胞至足夠數(shù)量后進(jìn)行分選，分選采用CD133抗體和ALDH1抗體的雙重標(biāo)記。讀取FCAS結(jié)果:CD133+ALDH1+所占比例約為1.82％，CD133-ALDH1所占比例約為79.25％。
　　6、低密度的CD133+ALDH1+細(xì)胞在6小時(shí)即可形成大量VM，而高密度CD133-ALDH1-細(xì)胞24小時(shí)僅能形成少量

12、VM。
　　將FCAS分選所得細(xì)胞以5×104個(gè)/ml的密度接種時(shí)，CD133+ALDH1+細(xì)胞6小時(shí)左右形成VM，CD133-ALDH1-細(xì)胞48小時(shí)仍未形成VM;以1×105個(gè)/ml的密度接種CD133-ALDH1-細(xì)胞24小時(shí)僅形成少量VM。
　　結(jié)論:
　　1、在累計(jì)藥物劑量相同的情況下，經(jīng)MTD模式化療的SKOV3腫瘤原代細(xì)胞比經(jīng)LDM模式化療的具有更強(qiáng)的VM形成能力、增殖力及侵襲力。
　　2、經(jīng)MTD