Rap1 shRNA的構建、體內(nèi)轉染效率鑒定以及對肝臟再生影響的實驗研究.pdf

1、目的： (1)應用RNA干擾技術合成選擇沉默rap1基因表達的三種載體。 (2)觀察rap1 shRNA1、rap1 shRNA2、rap1 shRNA3對小鼠肝臟細胞中Rap1基因表達和蛋白表達的干擾作用。 (3)探討rap1 shRNA對肝臟細胞再生的影響作用。 方法： (1)掃描Rap1 mRNA的全序列，記錄三個AA及下游19個核苷酸作為潛在作用靶點。GC含量控制在30％～65％之間。由B

2、LAST分析排除與其他基因有高度同源性的序列。由體外轉錄合成法合成三種Rap1 siRNA序列：Rap1 siRNA1，Rap1 siRNA2，Rap1 siRNA3和陰性對照質粒。并將其定向克隆到帶有卡那霉素抗性和增強綠色熒光蛋白的真核表達載體pGenesil-3上。酶切后，進行測序檢測。 (2)昆明小鼠40只，體重18～20g，隨機分成4組：Ⅰ組(轉染HK組)、Ⅱ組(轉染Rap1 shRNA1組)、Ⅲ組(轉染Rap1 shR

3、NA2組)、Ⅳ組(轉染Rap1 shRNA3組)。于0、16、24h腹腔內(nèi)注射Rap1 shRNA 2.0～2.5mg/kg(用PBS稀釋至1ml)；48小時后收集小鼠肝臟，用顯微熒光、定量RT-PCT、免疫組化檢測小鼠肝細胞中Rap1 shRNA的轉染率，Rap1基因表達以及蛋白質表達水平。 (3)昆明小鼠20只，體重18～20g，隨機分成2組：肝大部分切除組(A組，n=10)、肝大部分切除+Rap1 shRNA組(B組，n=

4、10)。A組、B組建立小鼠肝臟大部分切除肝臟再生動物模型，B組在關腹即刻、16、24h腹腔內(nèi)注射Rap1 shRNA2.0～2.5mg/kg(用PBS稀釋至1ml)；A組給予等量PBS； B組、A組，開腹取肝組織，免疫組化法測定肝臟組織中Rap1、ERK、cycline D1和Ki67蛋白表達情況，以及RT-PCR測定肝臟組織中Rap1 mRNA的表達。 結果： (1)雙酶切證實Rap1 siRNA表達載體克隆構建成功，

5、插入片段測序結果與合成的siRNA結果一致。 (2)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組小鼠肝臟細胞體內(nèi)轉染率均大于50％，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的Rap1 mRNA表達、Rap1蛋白表達均降低。其中Rap1 shRNA1干擾效果最佳；與轉染HK組的細胞Rap1基因、蛋白表達比較有顯著差異。 (3)B組肝臟組織細胞Rap1基因表達水平明顯高于A組，B組肝組織中Ki67蛋白表達水平，ERK蛋白表達水平，cycline D1蛋白表達水平，Rap