CD105(ENDOGLIN)在角膜新生血管形成中的作用的研究.pdf

1、目的：建立大鼠角膜新生血管模型，研究CD105與VEGF表達以及角膜新生血管形成的相關(guān)性，并應用RNA干擾技術(shù)（RNAi）研究針對CD105的siRNA，抑制CD105 在體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達，觀察CD105沉默后對VEGF表達和細胞生長的影響。
　　 方法：明膠海棉滴加堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)100 ng后,再用2%的瓊脂糖包裹制成緩釋藥丸。將干燥后的小丸植入SD大鼠角膜基質(zhì)層建立角膜新生血管模型,術(shù)后觀

2、察3周,照相,病理組織學檢查。按照不同時間，對角膜新生血管的情況進行形態(tài)學分析，用免疫組織化學、計算機圖像分析系統(tǒng)、RT-PCR法檢測新生血管形成不同時間點CD105和VEGF 在角膜中的表達。根據(jù)人的CD105 mRNA 序列（genebank accession number:）選擇3個不同的靶位點，分別合成3條CD105 siRNA，并同時合成陰性對照和陽性對照SiRNA。采用脂質(zhì)體介導的基因法轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞中，采

3、用RT-PCR檢測各組細胞CD105和VEGF mRNA表達水平，Western blot檢測技術(shù)法檢測干擾前后CD105和VEGF 蛋白表達水平，并用MTT法檢測HUVEC的細胞活力。
　　 結(jié)果：4天即可見新生血管從角膜緣向角膜中心伸展，成束狀，較稀疏，范圍較局限；10 d 達最高峰，觀察3 周尚未消退完全。病理組織學檢查HE 染色可見新生血管生長過程中未見明顯的白細胞浸潤。體內(nèi)實驗中免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示CD105

4、和VEGF的表達情況與新生血管的生長呈平行關(guān)系，且二者的表達情況也呈平行關(guān)系。體外實驗中，RT-PCR和Western blot的檢測表明，3號CD105 siRNA 能最有效沉默CD105的表達，轉(zhuǎn)染后的HUVEC中CD105 mRNA 水平和蛋白表達水平明顯下降。在CD105表達下降的同時，VEGF mRNA 水平和蛋白表達水平也呈平行下降。MTT結(jié)果表明CD105的下調(diào)導致了VEGF的下調(diào)從而使HUVEC的活力下降。