糖基化終末產(chǎn)物通過促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞CTGF表達(dá)對β演粉樣蛋白生成的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，在特定腦區(qū)形成老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)及神經(jīng)元和突觸缺失是其特征性病理改變。該病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，在AD腦中淀粉樣前體蛋白(amyloid precursorprotein，APP)主要經(jīng)β-分泌酶(β-secretion enzymel，BACE1)、γ

2、-分泌酶的主要活性成分-早老素(presenilinl，PS-1)的作用裂解為β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)。Aβ是SP的主要成分[1]，是誘發(fā)AD發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。關(guān)于APP異常代謝及Aβ生成的調(diào)控機(jī)制方面國內(nèi)外多項研究取得了突破性的進(jìn)展，但其具體機(jī)制仍然不十分明確。
　　 結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)是一種在多種細(xì)胞中都能表達(dá)的富含半胱氨酸

3、的分泌性多肽。其含有349個氨基酸，Mr約為38000，屬于即刻早期基因家族CNN成員之一。在正常情況下，CTGF在機(jī)體內(nèi)無表達(dá)或是僅少量表達(dá)。但大量研究證實，在病理狀態(tài)下，CTGF在多種纖維化疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，如皮膚、腎、肺、肝、心、視網(wǎng)膜、大血管等[3，4，5，6]。近年來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)SP和NFT中CTGF高表達(dá)，主要集中在其中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，并且隨病情加重而增加[7]；zhao等[8]研究發(fā)

4、現(xiàn)，AD患者腦中CTGF表達(dá)水平隨病情進(jìn)展而增加，并通過體外實驗證明CTGF可通過上調(diào)γ-分泌酶調(diào)控APP的異常代謝并促進(jìn)Aβ生成增加，從而說明CTGF可能是參與AD的發(fā)生和進(jìn)展的重要因素之一。但是，AD患者腦中CTGF表達(dá)增加的原因尚不清楚，而CTGF促進(jìn)APP異常代謝及Aβ生成增加的機(jī)制也仍不十分明確。
　　 糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是糖的醛基和蛋白質(zhì)的氨基酸

5、經(jīng)非酶糖基化反應(yīng)(Maillard反應(yīng))生成的一類終末不可逆聚合物，能介導(dǎo)多種病理過程。近年來眾多研究表明，AGEs參與阿爾茨海默病腦內(nèi)異常交聯(lián)沉積，氧化應(yīng)激，炎性反應(yīng)，神經(jīng)元喪失等病理過程。但AGEs及其受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)在阿爾茨海默病發(fā)生和發(fā)展中的具體機(jī)制尚未闡明[9]。AGEs是否對APP及Aβ生成有影響罕有報道。目前國內(nèi)外研究證實，在腎臟、血

6、管及視網(wǎng)膜組織中AGEs都能夠促進(jìn)CTGF的表達(dá)[10，11，12]。因此我們考慮，在AD患者腦中AGEs是否也能夠促進(jìn)CTGF的表達(dá)增加并通過一定的通路影響APP異常代謝及Aβ生成，進(jìn)而促進(jìn)AD的進(jìn)展。因此我們首次選擇AGEs-RAGE-CTGF通路對AD進(jìn)行研究，在細(xì)胞水平上探討AGEs在AD發(fā)病中的作用及其可能的機(jī)制，證明AGEs-RAGE-CTGF通路可能是AD發(fā)生和發(fā)展的又一機(jī)制，從而為AD的靶向治療提供必要的理論依據(jù)。

7、>　　 目的：
　　 (1)探討AGEs通過與其特異性受體(RAGE)結(jié)合對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞CTGF的表達(dá)、APP異常代謝及Aβ生成的影響。
　　 (2)探討CTGF與SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)APP代謝的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制。
　　 (3)明確AGEs-RAGE-CTGF通路在AD發(fā)生和發(fā)展中分子病理學(xué)機(jī)制及作用。
　　 方法：
　　 以培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞為模型，將細(xì)胞隨機(jī)分為

8、7組，正常對照組(NC組，加入生理鹽水)、牛血清白蛋白對照組(BSA組，加入牛血清蛋白200μg/mL)、糖基化牛血清白蛋白組(AGEs-BSA組，加入AGEs-BSA，200μg/mL)、AGEs-BSA+抗RAGE中和抗體組(AGEs-RAGE-Ab組，先加入單克隆中和抗體RAGE-Ab，1:100，1小時后再加入AGEs-BSA，200μg/mL)、RAGE中和抗體對照組(RAGE-Ab組，加入單克隆中和抗體RAGE-Ab，1：1

9、00)、AGEs-BSA+抗CTGF中和抗體組(AGEs-CTGF-Ab組，先加入單克隆中和抗體CTGF-Ab，1:100，1小時后再加入AGE-BSA，200μg/mL)、CTGF中和抗體對照組(CTGF-Ab組，加入單克隆中和抗體CTGF-Ab，1:100)。用MTT法觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及確定AGEs-BSA的最佳干預(yù)時間及濃度。通過ELISA方法檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞分泌Aβ1-40及Aβ1-42的水平；通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀

10、察各組細(xì)胞內(nèi)APP、RAGE、CTGF和Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達(dá)情況；通過蛋白免疫印記方法檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)APP、RAGE、CTGF、BACE1及PS-1蛋白生成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同蛋白濃度的BSA/AGEs-BSA對SH-SY5Y細(xì)胞生長狀態(tài)的影響
　　 MTT實驗結(jié)果顯示，200μg/mLAGEs-BSA作用48h后可以導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞活力下降至正常對照組的50％左

11、右，相同濃度的BSA對SH-SY5Y細(xì)胞活力沒有明顯影響。故本實驗選用200μg/mL AGEs-BSA干預(yù)細(xì)胞48h，與相對應(yīng)的其它組比較，觀察及檢測APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1及Aβ1-40、Aβ1-42的表達(dá)與生成。
　　 2.ELISA方法檢測AGEs-BSA對SH-SY5Y細(xì)胞分泌Aβ1-40、Aβ1-42的影響
　　 NC組、BSA組、RAGE-Ab組和CTGF-Ab組各組之間相比較其上清

12、液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平無明顯差異；在AGEs-BSA組中其上清液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平明顯高于NC組；而AGEs-RAGE-Ab組和AGEs-CTGF-Ab組中其上清液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平較AGEs-BSA組明顯減弱，但仍較NC組明顯增加。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察各組細(xì)胞內(nèi)APP、RAGE、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42的表達(dá)
　　 鏡下觀察AGEs-BSA組中SH-S

13、Y5Y細(xì)胞胞膜及胞漿中APP、RAGE、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白呈棕黃色陽性表達(dá)。與AGEs-BSA組相比，NC組、BSA組、RAGE-Ab組和CTGF-Ab組細(xì)胞胞膜及胞漿中APP、RAGE、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白僅少量表達(dá)，著色淺，4N相比較蛋白表達(dá)無明顯差異；AGEs-RAGE-Ab組細(xì)胞膜及胞漿中APP、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達(dá)降低，著色較淺，但仍明顯高于NC組；AGEs-C

14、TGF-Ab組細(xì)胞膜及胞漿中APP、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達(dá)降低，著色較淺，RAGE表達(dá)無明顯差異，但各指標(biāo)仍明顯高于NC組。
　　 4.蛋白免疫印跡檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞中APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1的蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析
　　 (1)NC組、BSA組、RAGE-Ab組和CTGF-Ab組各組之間相比較APP、BACE1、PS-1蛋白表達(dá)水平無明顯差異；在AGEs-BSA組中APP、

15、BACE1、PS-1蛋白表達(dá)水平明顯高于NC組(P<0.05)，分別是NC組的1.49倍、1.76倍和2.03倍；而AGEs-RAGE-Ab組中APP、BACE1、PS-1蛋白表達(dá)水平較AGEs-BSA組明顯減弱，下降率分別為18.26％、14.88％和29.51％(P<0.05)，但仍較NC組明顯增加，分別是NC組的1.22倍、1.51倍和1.43倍；AGEs-CTGF-Ab組中APP、BACE1、PS-1蛋白表達(dá)水平較AGEs-BS

16、A組明顯減弱，下降率分別為14.05％、10.69％和31.03％(P<0.05)，但仍較NC組明顯增加，分別是NC組的1.45倍、1.60倍和1.21倍。(圖9，10，11)
　　 (2)NC組、BSA組和CTGF-Ab組3組之間相比較RAGE蛋白表達(dá)水平無明顯差異；在AGEs-BSA組和AGEs-CTGF-Ab組中RAGE蛋白表達(dá)水平明顯高于NC組(P<0.05)，分別是是NC組的1.42倍和1.44倍；AGEs-BSA組和

17、AGEs-CTGF-Ab組相比RAGE蛋白表達(dá)水平無明顯差異。(圖12)
　　 (3)NC組、BSA組、RAGE-Ab組各組之間相比較CTGF蛋白表達(dá)水平無明顯差異；在AGEs-BSA組中CTGF蛋白表達(dá)水平明顯高于NC組(P<0.05)，是NC組的1.98倍；而AGEs-RAGE-Ab組中CTGF蛋白表達(dá)水平較AGEs-BSA組明顯減弱，下降率分別為30.29％(P<0.05)；但仍較NC組明顯增加，是NC組的1.38倍。(圖

18、13)
　　 結(jié)論：
　　 1.在細(xì)胞水平上，AGEs上調(diào)其特異性受體RAGE的表達(dá)，并通過與RAGE結(jié)合促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞CTGF的表達(dá)、APP異常代謝及Aβ1-40、Aβ1-42的生成增加。
　　 2.CTGF通過影響APP代謝酶(BACE1、PS-1)的作用參與APP的異常代謝及促進(jìn)Aβ1-40、Aβ1-42的生成。
　　 3.AGEs-RAGE-CTGF通路上調(diào)可能是AGEs促進(jìn)SH-SY5Y

19、細(xì)胞損傷的重要信號途徑，可能是參與阿爾茨海默病(AD)發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制之一。
　　 意義
　　 本研究應(yīng)用AGEs體外干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞，建立AGEs細(xì)胞損傷模型，用免疫細(xì)胞化學(xué)、ELISA和蛋白免疫印跡方法觀察AGEs對APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1的表達(dá)和Aβ生成的影響；并通過進(jìn)一步阻斷RAGE及CTGF的作用，檢測以上各項指標(biāo)的變化，探討AGEs通過作用其特異性受體RAGE誘導(dǎo)CTGF表達(dá)對A