胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ預(yù)防酒精引起成骨細(xì)胞抑制及凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:過(guò)量飲酒是當(dāng)今世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題，且飲酒的年輕人越來(lái)越多。長(zhǎng)期大量飲酒對(duì)骨骼系統(tǒng)有損害作用，但其機(jī)制仍不十分清楚。酒精對(duì)成骨細(xì)胞有直接作用，慢性飲酒者存在的營(yíng)養(yǎng)不良及小血管病變，加重了酒精的毒性作用。血清饑餓條件下，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞在酒精干預(yù)后增殖和功能的改變，直接反映了體內(nèi)損傷機(jī)制。慢性飲酒人群血清胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)水平降低，酒精還抑制了IGF-I受體酪氨酸激酶磷酸化。IGF-I促進(jìn)成骨細(xì)胞

2、的增殖和分化，外源性IGF-I對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)可能使其成為預(yù)防和治療酒精引起骨損害的有效方法。凋亡是細(xì)胞在不同條件下進(jìn)行的自發(fā)性死亡，多種因素對(duì)凋亡的影響調(diào)節(jié)了成骨細(xì)胞活性。Bcl-2、Bax分別是凋亡抑制基因和凋亡促進(jìn)基因的代表，其表達(dá)決定了凋亡的發(fā)生。 第一章大鼠成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及其功能鑒定 目的：改良組織塊培養(yǎng)法，體外分離培養(yǎng)新生大鼠成骨細(xì)胞，進(jìn)行功能鑒定，為實(shí)驗(yàn)研究提供高純度的成骨細(xì)胞。 方法：無(wú)菌條

3、件下取新生大鼠顱骨骨片，首先以0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化20 min，再按照傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法操作，接種到含15％新生牛血清DMEM中，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察。將分離的細(xì)胞采用差速黏附法純化后傳代培養(yǎng)，分別進(jìn)行I型膠原SP法免疫細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶鈣鈷法染色，鈣結(jié)節(jié)茜素紅S染色，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性測(cè)定，RT-PCR檢測(cè)骨鈣素mRNA表達(dá)。 結(jié)論：改良組織塊培養(yǎng)法能獲得大量高純

4、度的成骨細(xì)胞，操作方便。多種方法聯(lián)合應(yīng)用可作為體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)所得成骨細(xì)胞在傳代過(guò)程中保持成骨細(xì)胞特性，可供實(shí)驗(yàn)研究使用。 第二章IGF-I對(duì)酒精抑制體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和功能的影響 目的：探討成骨細(xì)胞在體外正常血清濃度條件下和血清饑餓條件下的增殖和功能情況，以及酒精對(duì)兩種條件下培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響和IGF-I的保護(hù)作用。 方法：應(yīng)用改良組織塊培養(yǎng)法體外分離純化的新生大鼠成骨細(xì)胞，以不同酒精濃度進(jìn)

5、行干預(yù)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖改變，確定適合的濃度。分6組在不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別為正常血清濃度組，正常血清濃度加酒精組，血清饑餓組，血清饑餓加酒精組，血清饑餓加IGF-I組和血清饑餓加IGF-I加酒精組，酒精濃度為100 mM。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性變化，RT-PCR法檢測(cè)骨鈣素mRNA表達(dá)。 結(jié)論：酒精能引起成骨細(xì)胞增殖和功能抑制，加重血清饑餓對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用，可能是酒精性骨損

6、害的機(jī)制之一。IGF-I能改善血清饑餓引起的成骨抑制，并抵抗酒精抑制細(xì)胞增殖的作用，可能成為探索治療酒精性骨損害的途徑之一。 第三章IGF-I對(duì)酒精誘導(dǎo)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 目的：從細(xì)胞凋亡的角度探討酒精對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和功能抑制的相關(guān)機(jī)制。了解凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)變化情況，以及IGF-I的作用。 方法：利用體外培養(yǎng)方法，對(duì)成骨細(xì)胞采

7、用不同干預(yù)，AO／EB染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，DNALadder檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段形成，流式細(xì)胞技術(shù)分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bel-2、Bax mRNA表達(dá)。 結(jié)論：酒精引起體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡，在酒精性骨損害的發(fā)生中起重要的作用。血清饑餓引起凋亡主要由于下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，酒精引起成骨細(xì)胞凋亡與Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)和Bax mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。IGF-I同時(shí)調(diào)節(jié)Bcl-2