血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)家族是目前研究較深入的血管生長(zhǎng)因子家族,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的成員包括VEGF-A、P1GF(placenta growthfactor,胎盤生長(zhǎng)因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E.VEGF-A,又稱VEGF,是其中最主要的成員<'[1-3]>.VEGF在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中由于不同的剪接方式形成幾種分子量不同的VEGF同種異構(gòu)體

2、,在人類主要為'VEGF<,121>、VEGF<,145>、VEGF<,165>、VEGF<,189>、VEGF<,206>等<'[1]>.表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是VEGF的主要分泌細(xì)胞之一,在某些炎癥性皮膚病如銀屑病、特應(yīng)性皮炎等情況下,皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF明顯增加<'[4]>,通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)真皮層微血管增生.角質(zhì)形成細(xì)胞主要分泌VEGF的兩種同種異構(gòu)體:VEGF<,121>和VEGF<,165>,其中VEGF<,165>效應(yīng)性

3、最強(qiáng)<'[4]>.VEGF 家族成員通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的VEGF受體 (VEGF receptor,VEGFR)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、微血管增生及增強(qiáng)血管通透性<'[3,5]>.目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的VEGF受體家族可分為兩大類:酪氨酸激酶受體和非酪氨酸激酶受體,其中前者包括VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,后者包括neuropilin-1(NRP-1),neuropilin-2(NRP-2).VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖、分化作用

4、主要是由VEGFR-2介導(dǎo)的<'[6,7]>.近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)VEGFR家族不僅表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上,而且在一些非血管內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá),包括某些腫瘤細(xì)胞<'[8]>、造血干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞<'[9]>、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞<'[10]>、黑素細(xì)胞<'[11]>等.我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在正常人的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞均有VEGFR-1、VEGFR-2的表達(dá),而在銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)V

5、EGFR-1、VEGFR-2更明顯<'[12]>.而Wilgus等<'[13]>用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在小鼠及正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞有VEGFR-1表達(dá),而沒(méi)有檢測(cè)到VEGFR-2的表達(dá).Kurschat等<'[14]>在HaCaT細(xì)胞中檢測(cè)不到VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá).證實(shí)VEGF受體在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)情況有助于進(jìn)一步研究VEGF受體在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)意義. [目的]： 明確VEGF受體在角質(zhì)形成

6、細(xì)胞中的表達(dá)情況,研究角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的VEGF除以旁分泌的形式發(fā)揮作用之外,是否還可以通過(guò)作用于角質(zhì)形成細(xì)胞自身表達(dá)的VEGF受體介導(dǎo)自分泌作用,介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移及粘附.重點(diǎn)研究VEGFR-2在角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF自分泌作用中是否起了主要的作用.同時(shí)研究他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及VEGF/VEGFR-2表達(dá)的影響. [方法]： 第一部分:培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,提取總RNA和蛋白質(zhì).以逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(Rever

7、se transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞VEGF受體mRNA的表達(dá)水平;以Western-blot法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞VEGFR蛋白質(zhì)的表達(dá)水平;以間接免疫熒光法對(duì)VEGF受體在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定位. 第二部分:使用外源性VEGFl65作為刺激因子刺激HaCaT細(xì)胞,同時(shí)使用VEGF的中和性單克隆抗體bevacizumab(Avastine)抑制內(nèi)

8、源性VEGF,觀察不同濃度VEGF<,165>和bevacizumab(Avastine)作用下HaCaT細(xì)胞增殖、粘附和遷移能力的變化.以10ng/ml VEGF<,165>刺激血清饑餓的HaCaT細(xì)胞,觀察其對(duì)VEGFR-2、PLCf-γ1、ERK1/2磷酸化的促進(jìn)作用,探討VEGF調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑.另外我們使用VEGFR-2的中和性抗體MAB3571預(yù)處理HaCaT細(xì)胞,以進(jìn)一步了解VEGFR-2在角質(zhì)形成細(xì)胞VE

9、GF自分泌作用的過(guò)程中是否起了重要作用.最后我們使用bevacizumab和MAB3571抑制/阻斷內(nèi)源性VEGF的作用,探討VEGF拮抗HaCaT細(xì)胞凋亡的作用. 第三部分:觀察不同濃度他克莫司作用下HaCaT細(xì)胞VEGF及其受體VEGFR-2表達(dá)的改變,另外我們還觀察了外源性10ng/ml VEGF<,165>是否能逆轉(zhuǎn)不同濃度他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用. [結(jié)論]： 一、角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞系Ha

10、CaT細(xì)胞在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)VEGFR家族成員VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2. 二、角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的VEGF,除以旁分泌的形式發(fā)揮作用之外,還可以通過(guò)作用于角質(zhì)形成細(xì)胞自身表達(dá)的VEGF受體發(fā)揮自分泌作用,從而介導(dǎo)其細(xì)胞活性,此即VEGF的自分泌作用.VEGFR-2在介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF自分泌作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用. 三、在HaCaT細(xì)胞中,VEGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)