用于食品中鼠疫耶爾森菌的納米膠體金快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、本文基于膠體金顆粒在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，能與蛋白質(zhì)分子的正電荷基一團，借靜電引力而形成牢固結(jié)合的特性標(biāo)記具有高度特異性的鼠疫莢膜F1多價抗體建立了納米膠體金快速檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法。根據(jù)抗體膠體金與被檢測物結(jié)合形成穩(wěn)定的肉眼可見結(jié)合物在一定波長范圍內(nèi)具有最大吸收峰實現(xiàn)了膠體金的定量檢測，主要研究內(nèi)容如下： l.鼠疫菌診斷血清的制備及多價抗體的純化。根據(jù)典型鼠疫菌在37~C富含血液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的F1封套抗原的特性對

2、典型鼠疫菌進行增菌，將獲得的菌種免疫健康家兔，采血分離F1多價抗體。分離的血清在56~C30分鐘滅能后測定其效價，與耐熱及不耐熱鼠疫菌體沉淀原作用為陰性或凝集效價不低于1：320(H)為合格，制備好的血清置2一10℃?zhèn)溆?。抗體純化方法采用硫酸銨鹽析后透析至無銨離子為止，冷凍保存。 2.凍干鼠疫菌F1抗原的制備。采用具有豐富莢膜抗原的鼠疫弱毒菌EV株用厚氏培養(yǎng)基大量增菌，于37~C培養(yǎng)收集菌體，用冷丙酮洗滌，置37℃自然干燥，除去

3、剩余丙酮，用乳缽研磨成菌粉，硫酸銨純化，用最適量的Fl抗原溶液致敏經(jīng)鞣酸處理的醛化綿羊紅血球，與鼠疫菌診斷血清(1：320(++)以上)做間接血凝反應(yīng)時，其效價應(yīng)達(dá)到1：50000(++)以上，而與假結(jié)核、布氏菌、土拉倫菌血清等應(yīng)為陰性反應(yīng)，即得到純化好的F1抗原，凍干保存。 3.制備膠體金和膠體金探針。采用檸檬酸鈉還原法，制得直徑為lOnm，大小均勻的膠體金顆粒。通過試驗確定F1膠體金最適標(biāo)記蛋白用量為12μg／ml，然后制備

4、標(biāo)記鼠疫F1抗體的膠體金探針，經(jīng)透射電鏡檢測合格，4~C保存?zhèn)溆谩?4.斑點金免疫滲濾法檢測鼠疫方法的建立。通過對倍比稀釋的鼠疫H抗原和典型的鼠疫EV76菌株進行檢測，9IGFA檢測F1抗原的最低檢出限為long／m1；對EV79。的最低檢出限為2．4×105cfu；其特異性除4株鼠疫菌外，不與包括小腸結(jié)腸炎和假結(jié)核耶爾森菌等其它細(xì)菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)；整個反應(yīng)過程在lOmin內(nèi)完成。 5.斑點金--薄層色譜法檢測鼠疫的實

5、驗研究。根據(jù)抗體膠體金與被檢測物結(jié)合形成穩(wěn)定的肉眼可見結(jié)合物在一定波長范圍內(nèi)具有最大吸收峰的特性，通過CS一930雙波長色譜掃描儀對樣品斑點進行檢測，斑點金一薄層色譜法對鼠疫F1抗原的最低檢出限為5ng；對EV7。的最低檢出限為L2×10scfu；且二者呈高度的正相關(guān)關(guān)系，前者相關(guān)直線方程為y=448．46737+2．51143x，R=0．9457,P<0．01，后者相關(guān)直線方程為y=375．76088+4．11231×lO-4x，R=

6、0．9242，P<0．05，實現(xiàn)了膠體金標(biāo)記技術(shù)的定量測定方法。 6.斑點金免疫滲濾法在我國各生態(tài)型鼠疫菌檢測中的應(yīng)用。隨機抽取分離自不同鼠疫自然疫源地的17個生態(tài)型的野生型鼠疫菌株17株以及對照菌株進行DIGFA檢測，結(jié)果只有17株鼠疫菌產(chǎn)生肉眼可見紅色斑點，而假結(jié)核菌，結(jié)腸炎菌等其它對照菌株未見紅色斑點，2．4×105cfu可見陽性反應(yīng)，lOmin可以完成檢測過程。 7.間接免疫金染色法在鼠疫菌形態(tài)學(xué)鑒定中的初步應(yīng)用