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1、目的:熱療(hyperthermia)可直接殺傷腫瘤細(xì)胞,并對(duì)腫瘤代謝、細(xì)胞周期分布、微循環(huán)產(chǎn)生作用,熱療還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,另外,熱療還可提高機(jī)體免疫功能。因此,熱療做為一種重要的腫瘤輔助性治療手段,臨床上常與其他常規(guī)治療方法聯(lián)合應(yīng)用,以期提高腫瘤的治療效果。但目前與腫瘤熱療相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床資料均有待于更加深入和充分的研究,某些關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)尚未取得突破,因此目前腫瘤熱療的巨大潛能尚未得到充分開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。本研究擬通過(guò)S
2、180荷瘤小鼠動(dòng)物模型,經(jīng)熱療、化療單獨(dú)或聯(lián)合處理后,測(cè)量各組平均瘤重,計(jì)算抑瘤率,測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期以及S180移植瘤組織內(nèi)的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)蛋白及基因表達(dá)水平,從而觀察熱、化療單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠移植性S180肉瘤的凋亡、增殖及血管再生的影響,并初
3、步探討其可能的作用機(jī)制。
方法:1、實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠60只,右后肢股部皮下接種S180腫瘤細(xì)胞株,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、熱療組、化療組、熱化療組。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至1cm3時(shí)分組進(jìn)行局部熱療、化療和熱化療。給化療組和熱化療組小鼠腹腔注射平陽(yáng)霉素0.2mg/只,熱化療組小鼠給藥30分鐘后立即對(duì)荷瘤的右后肢給予43±0.2℃恒溫水浴加熱1小時(shí)。然后熱療組給予同樣加熱處理。各實(shí)驗(yàn)組在給予第一次治療后每隔3天,重復(fù)治療一次。于第三次治療后2
4、4小時(shí),將小鼠頸椎脫臼處死,于小鼠后肢同一水平面離斷其荷瘤下肢,瘤體稱重,計(jì)算抑瘤率。離體標(biāo)本用生理鹽水沖洗3次,迅速將腫瘤組織切成多個(gè)小塊,部分置于70%乙醇4℃固定保存,以備流式細(xì)胞分析使用:部分置于10%中性甲醛固定室溫保存,以備免疫組織化學(xué)染色使用;部分置于液氮中固定以備RT-PCR使用。2、用流式細(xì)胞分析技術(shù)(FCM)測(cè)定各組S180移植瘤組織細(xì)胞周期、凋亡率及PCNA蛋白表達(dá)水平。3、免疫組化方法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平,以
5、微血管密度(MVD)作為定量檢測(cè)指標(biāo)。4、RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA、PCNA mRNA。5、數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)+s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小顯著法(least significant difference,LSD)作兩兩比較。直線相關(guān)分析方法比較兩指標(biāo)的相關(guān)性。P<0.05為差異有顯著性,P<0.01為差異有極顯著性
6、,P>0.05為差異無(wú)顯著性。
結(jié)果:1、瘤重及抑瘤率:空白對(duì)照組瘤重為(2.030±0.047)g;熱療組瘤重為(1.926±0.027)g,抑瘤率為5.12%;化療組瘤重為(1.844±0.044)g,抑瘤率為9.16%;熱化療組瘤重為(1.702±0.028)g,抑瘤率為16.16%;按α=0.05水準(zhǔn),任意兩組間總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本文試用Burgi修正公式,對(duì)熱療與化療的聯(lián)合應(yīng)用作療效判別
7、,q=1.17>1.15,因此熱療與化療聯(lián)合有協(xié)同作用。2、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)結(jié)果:(1)、細(xì)胞周期及凋亡率:對(duì)照組、熱療組、化療組、熱化療組G0/G1期細(xì)胞比例分別為43.94±2.06%、61.06±1.01%、58.02±2.62%和71.20±3.56%,S期細(xì)胞比例分別為33.92±1.36%、19.26±1.71%、25.58±1.89%和15.08±1.24%,其中各干預(yù)組與對(duì)照組相比,G0/G1期比例均上升、S期比例均
8、下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以熱化療組變化最為顯著。熱療組與化療組二者比較,熱療組S期細(xì)胞所占比例較少,化療組G2/M期細(xì)胞所占比例較少,變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、熱療組、化療組、熱化療組細(xì)胞凋亡率分別為4.70±0.27%、6.18±0.28%、10.14±0.25%、21.06±0.30%,各干預(yù)組之間以及干預(yù)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)、PCNA蛋白:對(duì)照組、熱療組、化療組、
9、熱化療組PCNA蛋白相對(duì)含量分別為319.24±1.34、313.50±1.18、310.74±0.77、304.40±1.45。各干預(yù)組之間以及干預(yù)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以熱化療組變化最顯著。3、應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤組織內(nèi)VEGF及MVD的表達(dá)水平:對(duì)照組、熱療組、化療組、熱化療組VEGF蛋白表達(dá)值分別為45.8±1.64、34.4±1.67、29.2±2.17、20.2±1.48,MVD值分別為19
10、.2±1.30、16.0±1.41、14.4±0.55、9.8±1.92,各干預(yù)組VEGF蛋白表達(dá)和MVD較對(duì)照組降低,除熱療組與化療組MVD值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外,各干預(yù)組之間以及干預(yù)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)行直線相關(guān)分析后,發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白表達(dá)與MVD間存在正相關(guān)性(r=0.915,P<0.01)。4、采用半定量RT-PCR檢測(cè)各組腫瘤組織內(nèi)VEGF mRNA、PCNA mRNA的表達(dá)水
11、平:對(duì)照組、熱療組、化療組、熱化療組VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)值分別為0.3880±0.0177、0.3392±0.0112、0.3178±0.0034、0.2952±0.0134,PCNAmRNA表達(dá)相對(duì)值分別為1.5522±0.0214、1.3348±0.0257、1.2776±0.0161、1.014±0.0255,各干預(yù)組VEGF mRNA、PCNAmRNA較對(duì)照組降低,各干預(yù)組之間以及干預(yù)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<
12、0.05)。
結(jié)論:1、熱療、化療、熱化療均可減輕小鼠移植性S180肉瘤的重量,對(duì)小鼠移植性S180肉瘤的增殖具有抑制作用,熱化療作用最顯著。2、熱療、化療、熱化療均可提高小鼠移植性S180肉瘤的細(xì)胞凋亡率,并可影響移植瘤組織的細(xì)胞周期,高熱使S期細(xì)胞比例下降,43℃熱療對(duì)S期細(xì)胞最敏感,促進(jìn)了小鼠移植性S180肉瘤的凋亡,熱化療聯(lián)合作用更強(qiáng)。3、熱療、化療均可下調(diào)小鼠移植性S180肉瘤的PCNA mRNA及蛋白的表達(dá),抑
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