玉米轉(zhuǎn)錄因子ABP5在植物逆境應(yīng)答中的功能分析.pdf

1、干旱、低溫、高鹽是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子。如何減少這些非生物逆境對(duì)植物的傷害，提高植物的抗逆能力，已成為目前農(nóng)業(yè)生物科研工作者的一項(xiàng)重要課題。 在生物或非生物逆境下，植物體都會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量脫落酸(ABA)和活性氧(ROS)。ABA是植物體內(nèi)重要激素之一，參與植物多種生理生化過程，眾多的研究證明ABA信號(hào)通路在非生物逆境中起著非常重要的作用?；钚匝跻环矫孀鳛樾盘?hào)分子參與細(xì)胞代謝、逆境信號(hào)傳導(dǎo)，為植物生命活動(dòng)所必需；但是活

2、性氧的大量積累又會(huì)對(duì)植物體造成嚴(yán)重的損傷。因此，活性氧水平在植物體內(nèi)是受到嚴(yán)格控制的，其產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中。了解植物體抗氧化基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)改良作物抗逆性有重要意義。 過氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)活性氧清除體系的重要成員。玉米的CAT1基因受ABA的調(diào)控，其啟動(dòng)子區(qū)域的ABRE2是響應(yīng)ABA調(diào)控所必需的順式元件。本實(shí)驗(yàn)室利用酵母單雜交的方法，對(duì)玉米幼胚17天和21天cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，克隆到與ABRE2特異結(jié)合的

3、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ABP5。得到該基因全長(zhǎng)cDNA序列1652bp，其中開放閱讀框?yàn)?020bp，并初步證明該基因在玉米中的表達(dá)受逆境和ABA的誘導(dǎo)。 本文的主要研究目的是鑒定ABP5的轉(zhuǎn)錄因子活性，并利用轉(zhuǎn)基因的手段分析ABP5在植物逆境反應(yīng)中的功能，試圖弄清ABP5與ABA、活性氧水平控制、抗逆相關(guān)基因表達(dá)以及植株抗逆性的關(guān)系。 本論文取得的主要研究結(jié)果如下： 1.利用酵母單雜交的方法驗(yàn)證ABP5與CAT1基

4、因啟動(dòng)子順式作用元件ABRE在酵母體內(nèi)存在特異性相互作用。 2.構(gòu)建pDB-ABP5ORF/N/M/C載體，在酵母Mav203中證實(shí)ABP5不具有轉(zhuǎn)錄激活功能。 3.構(gòu)建pCHF3-ABP5-GFP植物穩(wěn)定表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，陽(yáng)性植株在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示ABP5具核定位信號(hào)，定位于轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞的細(xì)胞核中。 4.通過Real-timePCR的方法，分析不同逆境處理下ABP5在玉米中的內(nèi)源表達(dá)

5、情況。ABA、NaCl、PEG、4℃低溫誘導(dǎo)ABP5的表達(dá)。H2O2抑制ABP5的表達(dá)。 5.對(duì)ABP5過表達(dá)系和野生型擬南芥植株進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)ABP5轉(zhuǎn)基因與野生型植株在種子萌發(fā)和早期生長(zhǎng)階段表型無明顯差異。但ABP5基因能夠使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株提前抽苔和開花，加快轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速度。 6.通過ABA平板上種子萌發(fā)率、幼苗存活率和根伸長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，證明ABP5提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA的敏感性。 7.對(duì)ABP5過表達(dá)

6、系5-33-5、5-4-2、5-26-7，RNAi系5R-3-29和野生型擬南芥植株進(jìn)行NBT和DAB染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ABP5基因過表達(dá)系植株體內(nèi)的活性氧(超氧陰離子，過氧化氫)水平高于野生型；RNAi系植株體內(nèi)的活性氧水平低于野生型。說明ABP5能促進(jìn)植物體內(nèi)ROS的積累。 8.對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株和野生型進(jìn)行抗非生物逆境生理實(shí)驗(yàn)，證明轉(zhuǎn)ABP5基因擬南芥對(duì)寒、旱、鹽及氧化逆境的耐受性低于野生型。 9.通過Real-ti

7、mePCR分析，在正常條件和NaCl處理?xiàng)l件下，抗逆相關(guān)基因RD29A、RD29B、COR47、COR414、CAT3、CSD2在ABP5轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量均低于野生型；RD22、ERD5、CSD1、RbhoD、ZAT12表達(dá)量均高于野生型；COR15A、FSD3、PER72表達(dá)量變化趨勢(shì)不同。 10.基因芯片分析顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥中一些與ROS代謝、生物逆境及開花相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化。 由上述結(jié)果初步推測(cè)，ABP