微囊藻毒素誘導SD大鼠睪丸支持細胞凋亡效應.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由水華藍藻產(chǎn)生的一類多肽化合物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)80多種MCs,MC-LR是研究較深入的一種。在關于MCs對生殖系統(tǒng)的毒性作用研究中,多涉及生殖器官、精子質(zhì)量和相關激素,而關于細胞分子水平的機制研究報道尚少。
   目的:
   本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細胞為模型研究MC-LR對生殖細胞活性的影響及其誘導支持細胞的凋亡,同時檢測凋亡相關基因P53、bax和bcl-2mRNA

2、及蛋白水平的表達,從基因及蛋白水平闡述MC-LR對生殖細胞的凋亡的調(diào)控作用。
   方法:
   1.從未成年雄性SD大鼠睪丸分離純化睪丸支持細胞,建立原代培養(yǎng)細的胞模型。
   2.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和中性紅(neutralred,NR)實驗檢測MC-LR對支持細胞活性的影響。
   3.Hoechst熒光染色法檢測MC-LR誘導的凋亡睪

3、丸支持細胞。
   4.反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription—polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測MC-LR染毒后細胞中凋亡相關基因p53、bcl-2、bax mRNA水平的表達情況。
   5.Western blot法檢測不同劑量MC-LR染毒不同時間對支持細胞凋亡相關蛋白P53、Bcl-2、Bax的影響。
   6.Caspase-3底物切除法

4、檢測MC-LR對細胞中caspase.3的活性改變。
   結果:
   1.低劑量MC-LR(0.02~1μg/ml)染毒睪丸支持細胞24h和48h后,MTT和NR檢測結果顯示細胞活性升高。高劑量MC-LR(10μg/ml和20μg/ml)染毒24h和48h細胞活性顯著降低(P<0.05)。
   2.Hoechst熒光染色結果:隨著MC-LR劑量的增高誘導的凋亡細胞增多。
   3.RT-PCR結果:

5、支持細胞暴露MC—LR24h,10μg/ml劑量組中p53 mRNA相對表達量與對照組相比明顯升高(P<0.05)。1μg/ml劑量組bcl-2 mRNA相對表達量升高(P<0.05),10μg/ml組表達量明顯降低(P<0.05)。bax mRNA在10μg/ml劑量組細胞中相對表達明顯升高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);暴露48h后各目的基因mRNA相對表達量與暴露24h時的趨勢相同,但其10μg/ml組與對照組相比表達量的變化

6、更明顯且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
   4.Western blot結果:睪丸支持細胞暴露于MC-LR24h,與對照相比1μg/ml劑量組P53蛋白相對表達量升高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Bax和Bcl-2蛋白相對表達量改變不明顯。10μg/ml劑量組P53和Bax蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05),Bcl-2相對表達量顯著降低(P<0.05)。
   MC-LR作用支持細胞48h后,1μg/m

7、l劑量組P53蛋白表達量升高但差異無統(tǒng)計學意義,Bax表達量顯著降低(P<0.05),Bcl.2表達量則顯著升高(P<0.05)。10μg/ml劑量組P53和Bax相對表達量顯著升高(P<0.05),Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)。
   5.Caspase-3檢測結果:支持細胞染毒MC-LR24h和48h,與對照組相比1μg/ml劑量組細胞中caspase-3活性變化不明顯;10μg/ml劑量組細胞中caspase-

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