微囊藻毒素-LR對(duì)魚類分子毒性效應(yīng)的研究.pdf

1、隨著水體富營養(yǎng)化加劇，藻類所引起的水污染問題己越來越引起人們的關(guān)注，藍(lán)藻是目前已知產(chǎn)生毒素最多、對(duì)人類健康造成的危害最大的藻類。微囊藻毒素-LR（microcystins-LR，MC-LR）是有毒藍(lán)藻細(xì)胞合成的二級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種細(xì)胞內(nèi)毒素。微囊藻毒素可影響魚類的胚胎發(fā)育和生長，也可引起肝臟、腎臟等內(nèi)部器官的病理變化，和導(dǎo)致魚體的氧化損傷等。然而，有關(guān)微囊藻毒素對(duì)魚類分子水平上的毒性效應(yīng)的研究則很少。本研究以斑馬魚和鳙魚為對(duì)象，采用實(shí)時(shí)

2、熒光定量PCR、分子克隆和免疫印跡技術(shù)在分子水平上揭示了MC-LR對(duì)魚類的毒理效應(yīng)。
　　 本研究中采用人工繁殖的方法收集健康的斑馬魚胚胎，待孵化出膜后，用濃度為200μg/L和800μg/L MC-LR溶液浸泡幼魚進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。在染毒12h，24h，48h，96h和168h后取樣。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了斑馬魚幼魚的重組激活基因Rag（Rag1，Rag2）、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（LCK）、T細(xì)胞受體α（TCRα）

3、、轉(zhuǎn)錄因子GATA1、鋅指紋蛋白（Ikaros）和熱休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60、HSP27）的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)Rag1、Rag2、LCK、TCRα、GATA1和Ikaros都有表達(dá)上升趨勢(shì)，特別是在800μg/L MC-LR處理后，在很多時(shí)間點(diǎn)內(nèi)表達(dá)上升明顯，與對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）；熱休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60、HSP27）的表達(dá)變化更為明顯，在200μg/L和800μg/L MC-

4、LR處理后，所有熱休克蛋白基因的表達(dá)均有上升，且差異明顯（P<0.05），尤其是HSP70在800μg/L MC-LR處理168h后，其表達(dá)量上升了近300倍。這說明MC-LR可影響斑馬魚幼魚早期發(fā)育的重要調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子和熱休克蛋白的表達(dá)，從而推測(cè)MC-LR可能影響斑馬魚的早期發(fā)育和免疫系統(tǒng)功能。
　　 本研究通過分子克隆技術(shù)中的RACE方法獲得了兩個(gè)鳙魚去毒酶相關(guān)基因的cDNA全長，并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析及推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列分

5、析。
　　 谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)基因cDNA全長903個(gè)核苷酸（nucleotides，nt）（GenBank accession no. FJ357422），包含426 nt的開放閱讀框，編碼142個(gè)氨基酸，其中5′、3′端非編碼區(qū)分別為182 nt和292 nt，推測(cè)GPX蛋白的分子式C740H1144N196O213S4，分子量為16.3226千道爾頓，等電點(diǎn)5.93，

6、預(yù)測(cè)該蛋白為水溶性。系統(tǒng)進(jìn)化分析和氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果表明，鳙魚GPX與草魚、鰱魚、鮒魚的相似性較高，分別為99.3%，97.9%，93.0%。
　　 谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)基因cDNA全長831個(gè)核苷酸（nucleotides，nt）（GenBank accession no. FJ349627），包含717 nt的開放閱讀框，編碼239個(gè)氨基酸，其5′、3′端非編碼區(qū)分別為74 n

7、t和40 nt，推測(cè)GR蛋白的分子式C1131H1796N324O347S7，分子量為25.709千道爾頓，等電點(diǎn)7.71，預(yù)測(cè)該蛋白為水溶性。系統(tǒng)進(jìn)化分析和氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果表明，鳙魚GR與斑馬魚、大西洋鮭相似性較高，分別為90.8%和81.1%。
　　 在健康鳙魚中，對(duì)兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)物的器官組織分布進(jìn)行了詳細(xì)的分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，GPX和GR在所有被檢測(cè)的鳙魚組織中都有表達(dá)，呈組成型表達(dá)，且具有相似的

8、組織分布模式，即在肝臟中的表達(dá)最高，其次是脾臟、鰓、中腎、頭腎等，腦和心臟中的表達(dá)較低。分別構(gòu)建GPX和GR基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pQE40-GPX和pQE40-GR，通過原核表達(dá)、表達(dá)蛋白純化、并制備多克隆抗體，對(duì)腦、鰓、心臟、頭腎、中腎、肝臟、肌肉、脾臟、和胸腺等器官中的目的基因蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。免疫印跡Western blotting結(jié)果顯示GPX蛋白在各個(gè)組織中廣泛表達(dá)。
　　 經(jīng)腹腔注射MC-LR（50μg/kg bo

9、dy weight）對(duì)鳙魚進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)，以注射滅菌生理鹽水作為對(duì)照，分別于染毒后6h，12h，24h，48h，96h和168h后取處理組和對(duì)照組的肝臟、脾臟、頭腎、腸道。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)鳙魚的GPX和GR表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)在MC-LR誘導(dǎo)后GPX在肝臟、脾臟和頭腎中過量表達(dá)，差異顯著（P<0.05）；GR在腸道和頭腎中，表達(dá)變化顯著（P<0.05），上升倍數(shù)較高，而在肝臟和脾臟中GR的表達(dá)雖然也是增加的，但變化沒有腸道和頭腎中的