隱孢子蟲病免疫學(xué)診斷方法的建立和應(yīng)用及其免疫預(yù)防研究.pdf

1、作為腹瀉病常見(jiàn)病原之一的隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）能侵入人或動(dòng)物的腸道，引起隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis）。在隱孢子蟲的眾多種類中，微小隱孢子蟲（Cryptosporidiumparvum）是最常見(jiàn)且危害最大的。對(duì)免疫功能發(fā)育不全或缺陷的宿主，隱孢子蟲會(huì)造成嚴(yán)重的傷害，甚至?xí){生命。目前，隱孢子蟲病防控研究面臨著缺乏敏感、特異、便捷的診斷技術(shù)和有效的治療、免疫預(yù)防方法。因而，篩選免疫原性好、

2、免疫反應(yīng)性高的隱孢子蟲抗原分子，研制敏感、特異的診斷技術(shù)和高保護(hù)效果的預(yù)防疫苗是當(dāng)前隱孢子蟲病研究的關(guān)鍵和重要方向。
　　本研究以重組微小隱孢子蟲CP15/60（rCP15/60）和類鈣調(diào)蛋白(rCML)為抗原，建立了2個(gè)隱孢子蟲病間接ELISA診斷方法，并與nested PCR方法進(jìn)行了比較;利用建立的方法，對(duì)從上海地區(qū)3個(gè)屠宰場(chǎng)采集的豬田間血清進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種重組蛋白的最適包被濃度均為2μg/mL，一抗血清的最佳稀釋

3、度均為1∶100，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度也均為1∶800。與nested PCR法檢測(cè)結(jié)果比較，rCP15/60-ELISA的陽(yáng)性和陰性符合率分別為100.0％和80.0％; rCML-ELISA的陽(yáng)性和陰性符合率分別為66.7％和60.0％。利用2種方法分別對(duì)291份田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果rCP15/60-ELISA法檢測(cè)的陽(yáng)性率為59.5％，rCML-ELISA法的陽(yáng)性率為51.5％，前者比后者更敏感。交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示，2種方法對(duì)豬附

4、紅細(xì)胞體感染豬血清、弓形蟲感染豬血清、豬瘟病毒感染豬血清、豬藍(lán)耳病毒感染豬血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。利用rCP15/60-ELISA方法對(duì)341份豬田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率為56.89％;利用rCML-ELISA方法對(duì)353份豬田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為44.47％，提示這2種ELISA方法的敏感性較高、特異性較強(qiáng)，可用于實(shí)驗(yàn)室初篩和隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查。
　　為了觀察CP15/60、CML2種抗原制備的疫苗對(duì)小鼠隱孢子蟲病

5、的免疫預(yù)防效果，并與其它部分抗原進(jìn)行比較，將重組蛋白rCP15/60、rCML，以及rCpT全、rCpTm、rENO、rP23四個(gè)重組蛋白分別與弗氏佐劑充分乳化，通過(guò)多次皮下注射的方式免疫小鼠，觀察其體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng);同時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行泰澤隱孢子蟲卵囊人工感染，觀察免疫小鼠的排卵囊情況。結(jié)果顯示，6個(gè)亞單位疫苗免疫試驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體水平、TNF和IL-5細(xì)胞因子、脾臟CD4+和CD8+含量都有不同程度提高，說(shuō)明6組亞單位疫

6、苗都特異性地誘導(dǎo)產(chǎn)生了體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，rCP15/60免疫組的減卵囊率達(dá)45.57％，僅次于rENO免疫組，高于其它各組;rCML免疫組的減卵囊率達(dá)34.08％，次于rENO免疫組，與rP23免疫組基本相當(dāng)，但高于rCpTm和rCpT全免疫組。上述結(jié)果表明，利用rCP15/60和rCML制備的亞單位疫苗對(duì)小鼠泰澤隱孢子蟲感染均有較好的免疫保護(hù)效果，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生了顯著的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是隱孢子蟲病預(yù)防疫