類真皮對ES源表皮樣干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、本研究分為如下4個(gè)部分:第一部分ES細(xì)胞的培養(yǎng)方法:ES細(xì)胞儲(chǔ)存于-160℃.在42℃快速融解和PBS洗滌后,在5﹪C0<,2>,37℃,含有白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor,LIF)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),或用成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞,培養(yǎng)ES細(xì)胞,檢測其堿性磷酸酶的表達(dá)及體內(nèi)形成畸胎瘤的能力.第二部分ES細(xì)胞定向分化為表皮樣干細(xì)胞的研究方法:無菌條件下收集足孕剖宮產(chǎn)羊膜

2、,并剪切至合適尺寸,置入6孔板內(nèi).將胰酶消化法收集的ES細(xì)胞種植在羊膜表面,培養(yǎng)4-5天后,免疫組化法檢測β 1整合素、CK15和CK19等表皮干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá).第三部分類真皮的構(gòu)建及其組織相容性研究方法:構(gòu)建如下幾種類真皮:(1)將膠原、6-硫酸軟骨素和殼多糖按一定比例混合,加入成纖維細(xì)胞制備成復(fù)合膠原凝膠(CGC),再與明膠海綿(GS)混合,構(gòu)建成CGC-GS類真皮.(2)將PGA縫線編織成小網(wǎng),加入含有成纖維細(xì)胞的膠原凝膠,構(gòu)建

3、成PGA類真皮.(3)將PLGA膜片與含有成纖維細(xì)胞的膠原凝膠混合,構(gòu)建成PLGA類真皮.(4)單用膠原凝膠、明膠海綿、PGA或PLGA等作為對照.將上述類真皮移植到129小鼠皮下,每周取材,觀察10周.第四部分ES源表皮樣干細(xì)胞在類真皮內(nèi)的存活與分化方法:用Hoechst 33342標(biāo)記ES源表皮樣干細(xì)胞并種在CGC-GS類真皮和PGA類真皮內(nèi),移植到129小鼠皮下.每周取材,共觀察10周.總結(jié):1.小鼠E14胚胎干細(xì)胞可擴(kuò)增傳代,體