P311在表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究主要分為以下三個方面:P311在EpMyT中的具體作用，P311通過TGFβ1/Smad信號通路調(diào)控EpMyT，P311調(diào)控TGFβ1的可能分子機制。
　　方法:
　　1.P311在表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。
　　1.1 P311在體外小鼠和人原代表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。
　　1.2 P311在體內(nèi)小鼠和人燒傷創(chuàng)面EpMyT中的作用。
　　1.3 燒

2、傷創(chuàng)面微環(huán)境對EpSCs內(nèi)P311和α-SMA表達的影響。
　　2.P311通過TGFβ1/Smad信號通路調(diào)控EpMyT。
　　2.1 P311對TGFβ1/Smad通路的調(diào)控作用。
　　2.2 TβRⅠ/Ⅱ抑制劑LY2109761、Smad3siRNA和外源性TGFβ1對P311引起的EpMyT的調(diào)控作用。
　　3.P311調(diào)控TGFβ1表達的分子機制。
　　3.1 P311調(diào)控TGFβ1表達的主要階段

3、。
　　3.2 P311調(diào)控TGFβ1UTR活性的可能機制。
　　3.3 P311可能通過eIF6間接調(diào)控TGFβ1的蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.P311在體外小鼠和人原代表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。
　　1.1 成功分離培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染小鼠和人原代EpSCs。
　　培養(yǎng)的EpSCs呈克隆樣生長，每個細胞呈立方形，并且95％以上的細胞為CD49f+CD71-EpSCs。腺病毒轉(zhuǎn)染48小時后

4、，95％以上EpSCs表達GFP，P311mRNA含量明顯升高。
　　1.2 P311促進小鼠表皮干細胞向肌成纖維樣細胞，而不是肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。
　　P311腺病毒轉(zhuǎn)染72小時后，小鼠EpSCs體積變大、呈長梭形和扁平狀，α-SMA和Vimentin陽性細胞比例升高、E-cadherin陽性細胞比例下降，細胞骨架由網(wǎng)狀皮質(zhì)排列重排為應力絲結(jié)構(gòu)，α-SMA蛋白和mRNA水平分別升高為空載體組的2.69倍(P＜0.05)和1

5、.56倍(P＜0.01)，Vimentin蛋白水平升高為空載體組的1.72倍(P＜0.05)，E-cadherin和β1integrin蛋白水平分別降低為空載體組的32％和68％(P＜0.05)。P311組EpSCs遷移指數(shù)升高到空載體組的6.29倍(P＜0.01)，Ⅰ型膠原和MMP2蛋白水平分別升高到空載體組的11.21倍和1.45倍(P＜0.05)，但P311組和空載體組膠原凝膠均未出現(xiàn)明顯收縮。
　　1.3 P311促進人表

6、皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化。
　　P311高表達后，人EpSCs內(nèi)α-SMA+細胞比例顯著升高(35％vs3％，P＜0.01)，E-cadherin陽性細胞比例顯著降低(22％vs63％，P＜0.01)。同時，α-SMA蛋白水平升高為空載體組的2.09倍(P＜0.05)，E-cadherin和β1integrin蛋白水平分別降低為空載體組的57.68％和32.87％(P＜0.05)。
　　2.P311在人和小鼠燒傷創(chuàng)面E

7、pMyT中的可能作用。
　　2.1 P311敲除小鼠燒傷創(chuàng)面愈合和再上皮化速度減慢。
　　大體觀察發(fā)現(xiàn)，P311敲除小鼠傷口絕對面積和面積百分比在傷后2天、4～7天均顯著高于P311野生型小鼠。HE染色發(fā)現(xiàn)，傷后4天和7天P311敲除小鼠傷口再上皮化速度顯著慢于P311野生型小鼠。傷后7天，P311敲除小鼠傷口的表皮間距顯著寬于P311野生型小鼠(9.87mm vs6.82mm，P＜0.05)，新生表皮長度顯著短于野生型小鼠

8、(1.48mmvs2.14mm，P＜0.05)。
　　2.2 P311敲除小鼠燒傷創(chuàng)面中EpMyT水平可能下降。
　　免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，P311敲除小鼠新生表皮中Vimentin+細胞數(shù)目低于P311野生型小鼠，而未觀察到表皮α-SMA的特異性表達。P311敲除小鼠創(chuàng)面內(nèi)Vimentin、TGFβ1、TWIST1和Snail2mRNA水平均顯著低于P311野生型小鼠。并且，P311敲除小鼠創(chuàng)面內(nèi)β1integrin蛋白水平顯

9、著高于P311野生型小鼠。P311敲除小鼠正常皮膚和燒傷創(chuàng)面中Vimentin、LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白水平顯著低于P311野生型小鼠。
　　2.3 P311在人燒傷創(chuàng)面EpMyT中的可能作用。
　　燒傷創(chuàng)面表皮中α-SMA、Vimentin、P311陽性細胞均多于正常皮膚，共染發(fā)現(xiàn)人燒傷創(chuàng)面表皮中存在著P311+α-SMA+細胞和P311+Vimentin+細胞。
　　3.燒傷創(chuàng)面微環(huán)境對EpSCs內(nèi)P

10、311和α-SMA mRNA表達的影響。
　　IL1β和TNFα使EpSCs內(nèi)P311mRNA水平升高40倍以上(P＜0.01)，缺氧使其升高7.58倍(P＜0.01)，IL6使其升高4.05倍(P＜0.05)。并且，IL1β、TNFα、IL6和缺氧均引起EpSCs內(nèi)α-SMA mRNA水平明顯升高(P＜0.05)。
　　4.P311對TGFβ1/Smad通路的調(diào)控作用。
　　4.1 P311對TGFβ1表達的調(diào)控作用

11、。
　　P311組EpSCs內(nèi)LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白的水平分別升高到空載體組的4.21和6.89倍(P＜0.01)，TGFβ1mRNA水平下降至空載體組的78.81％(P＜0.01)，TβRI和TβRⅡmRNA水平分別升高到空載體組的1.72倍(P＜0.05)和2.22倍(P＜0.01)。P311敲除小鼠EpSCs的培養(yǎng)上清內(nèi)TGFβ1總蛋白水平降至P311野生型小鼠EpSCs的51.15％(P＜0.05)。

12、>　　4.2 P311促進Smad2和Smad3蛋白的磷酸化。
　　P311組EpSCs內(nèi)pSmad2和pSmad3比例分別升高為空載體組的2.51倍和2.80倍(P＜0.01)。外源性TGFβ1刺激下，P311敲除小鼠EpSCs內(nèi)pSmad2和pSmad3比例分別降至P311野生型小鼠EpSCs的52.17％和65.71％(P＜0.05)。但敲除或高表達P311對Smad2和Smad3總蛋白水平無顯著影響。
　　5.TβR

13、Ⅰ/Ⅱ抑制劑LY2109761阻斷P311引起的EpMyT。
　　LY2109761可以顯著抑制P311引起的pSmad2和pSmad3表達升高。LY2109761可以使P311高表達EpSCs失去肌成纖維細胞樣形態(tài)。并且，LY2109761將P311組α-SMA+細胞比例從39.99％降至7.93％，將E-cadherin+細胞比例從8.37％升至43.43％(P＜0.01)。同時，LY2109761可顯著抑制P311組EpSC

14、s內(nèi)升高的α-SMA和Vimentin蛋白水平，提高P311組EpSCs內(nèi)降低的β1integrin和E-cadherin蛋白水平(P＜0.01)。此外，LY2109761可顯著降低P311組EpSCs內(nèi)Ⅰ型膠原和MMP2蛋白水平。
　　6.Smad3siRNA阻斷P311引起的EpMyT。
　　Smad3siRNA可使Smad3蛋白水平降低為P311組的40.64％(P＜0.05)，幾乎完全抑制pSmad3的表達(P＜0.

15、01)。P311+Smad3siRNA組EpSCs內(nèi)α-SMA水平顯著低于P311組和P311+mock siRNA組(P＜0.01)，E-cadherin水平顯著高于P311組和P311+mocksiRNA組(P＜0.01)，但與空載體組無顯著差異。
　　7.外源性TGFβ1可以恢復P311敲除小鼠EpMyT的能力。
　　TGFβ1刺激后，P311敲除小鼠和野生型小鼠EpSCs內(nèi)α-SMA蛋白水平均顯著升高。并且，TGFβ

16、1刺激后的P311敲除小鼠EpSCs內(nèi)α-SMA蛋白水平與TGFβ1未刺激的P311野生型小鼠EpSCs內(nèi)α-SMA蛋白水平無顯著差異。
　　8.P311通過促進啟動子甲基化和提高UTR活性調(diào)控TGFβ1表達。
　　9.P311調(diào)控TGFβ1UTR活性的可能機制。
　　10.P311可能通過eIF6間接調(diào)控TGFβ1蛋白表達。
　　結(jié)論:
　　本研究首次證實，P311是一種新的表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分

17、化的調(diào)控因子，并且TGFβ1/Smad通路在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。P311通過增強TGFβ1啟動子甲基化抑制TGFβ1轉(zhuǎn)錄，通過結(jié)合并激活TGFβ15'-UTR和3'-UTR促進TGFβ1翻譯。燒傷創(chuàng)面局部的炎性因子和缺氧微環(huán)境可誘導表皮干細胞P311的表達。敲除P311可導致燒傷創(chuàng)面愈合延遲。因此，研究結(jié)果不僅可以表明表皮干細胞可能是皮膚創(chuàng)面愈合中肌成纖維細胞的另一重要來源，更為重要的是，發(fā)現(xiàn)了一種新的皮膚創(chuàng)面愈合機制，即:炎性因子