ZnHA-TiO2復(fù)合涂層的構(gòu)建及其生物相容性和抗菌性能研究.pdf

1、目的：羥基磷灰石(HA)涂層的Ti種植體是目前種植體表面改性的主要方向,但是隨著臨床應(yīng)用的增加,HA涂層在應(yīng)用上表現(xiàn)出一定的局限性,由于HA在體液中有一定的溶解度,植入一段時(shí)間后會出現(xiàn)涂層崩解,導(dǎo)致骨結(jié)合失敗;脫落的涂層材料顆粒在種植體周圍積聚后,激發(fā)各種吞噬細(xì)胞反應(yīng),破骨細(xì)胞活躍引起骨吸收,導(dǎo)致種植體松動;涂層脫落使細(xì)菌容易侵入,引發(fā)種植體周圍炎。因此,探求一種理想的加工工藝和方法提高HA涂層與Ti基體結(jié)合力,促進(jìn)種植體早期骨整合,預(yù)

2、防種植體周圍炎的發(fā)生將是我們研究的主要方向。
　　 鋅作為人體必需的微量元素之一,是很多酶的關(guān)鍵結(jié)合因子,在體內(nèi)參與了300多種酶的代謝,通過調(diào)節(jié)激素、酶的活性影響骨代謝;Zn2+對細(xì)胞的增殖、分化,特別是DNA的合成和有絲分裂有重要的作用,是DNA復(fù)制所必須的;能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,對維持細(xì)胞因子的正常結(jié)構(gòu)是必要的,這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)骨形成;Zn2+被認(rèn)為是信號調(diào)節(jié)分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞的生長周期;不僅能夠促進(jìn)

3、成骨細(xì)胞的生長而且能夠間接抑制破骨細(xì)胞骨吸收。同時(shí),Zn2+具有抗菌作用,當(dāng)?shù)竭_(dá)微生物細(xì)胞膜時(shí),牢固吸附并穿透細(xì)胞壁進(jìn)入菌體內(nèi),使病原菌的蛋白質(zhì)變性,破壞細(xì)菌細(xì)胞合成酶的活性,降低環(huán)境的pH值等,使細(xì)菌喪失分裂增殖能力而死亡。如果Zn2+能夠在種植體周圍緩慢釋放,不僅能夠促進(jìn)種植體周圍骨形成,而且可以預(yù)防種植體周圍炎的發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過微弧氧化(MAO)的方法在Ti表面形成二氧化鈦(TiO2)層,多孔的TiO2層可以提高涂

4、層的結(jié)合強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,通過溶膠凝膠的方法將Zn2+引入到HA涂層中,制備ZnHA/TiO2復(fù)合涂層,考察改性材料的表面形貌和化學(xué)組成的變化,以及改性材料對成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為和抗菌性能的影響。探索更符合臨床需要的種植體材料。
　　 方法：
　　 一、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的制備及性能分析
　　 1、Ti表面ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的制備將直徑為10mm的純Ti棒切割成厚度為1mm的圓片,SiC砂紙打磨

5、。采用BPP-3型MAO電源對樣品進(jìn)行MhO,取一定量P(C2H5O)3、Ca(NO3)2·4H2O、Zn(NO3)2·6H2O,分別得到Ca2+濃度為2mol/L,Zn/Ca摩爾比為0.0025、0.005、0.01三種不同Zn2+濃度的前體溶液,隨后用此溶液在樣品上分別溶膠凝膠得到實(shí)驗(yàn)組樣品ZnHA/TiO2-1、ZnHA/TiO2-2、ZnHA/TiO2-3。
　　 2、物理形貌和物相分析在JSM-5600LV型掃描電鏡上

6、進(jìn)行HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂層后各組Ti片的表面形貌觀察。采用XRD-6000型X射線衍射儀對涂層進(jìn)行物相分析。
　　 3、Zn2+釋放濃度的測定按照Tris緩沖液與樣品表面積為1ml/3cm2的比例,將樣品于37℃無菌環(huán)境下靜置24、48、72、144和288小時(shí),采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國Perkin Elmer公司,Optima2000DV)測定各組樣品在Tris緩沖液中Zn2+的釋放濃度
　　

7、 二、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的抗菌性能
　　 1、牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)的抑菌實(shí)驗(yàn)采用材料表面直接細(xì)菌培養(yǎng)法,通過倍比稀釋各樣本后接種培養(yǎng),菌落計(jì)數(shù)觀察HA/TiO2和ZnHA/TiOz涂層對P.gingivalis的抑制作用。
　　 2、牙齦卟啉單胞菌的掃描電鏡觀察應(yīng)用JSM-5600LV型掃描電鏡觀察Ti片表面牙齦卟啉單胞菌的菌體形態(tài)變化。
　　 三、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的生物相

8、容性
　　 1、MTT實(shí)驗(yàn)將MG-63制成5×103cells/ml的細(xì)胞懸液,接種于3塊24孔板中,每板復(fù)種3孔,各孔加入500μ l的細(xì)胞懸液,分別培養(yǎng)24h、48h、72h,轉(zhuǎn)入新的24孔板,PBS清洗后加入5mg/ml的MTT30μ l,培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,加入750μ l DMSO,震蕩溶解10分鐘,將各孔的液體150μ1轉(zhuǎn)入相應(yīng)酶標(biāo)板,用酶標(biāo)儀測定在490nm波長處的吸光度值。
　　 2、PI單染法流式細(xì)胞

9、儀分析應(yīng)用PI單染法流式細(xì)胞儀分析MG-63在HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂層表面培養(yǎng)48h后的細(xì)胞周期變化。
　　 3、掃描電鏡觀察通過掃描電鏡觀察MG-63細(xì)胞在HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂層表面,分別培養(yǎng)24h、48h后,細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　 4、免疫熒光觀察FITC結(jié)合的鬼筆環(huán)肽和PI雙染,于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察MG-63細(xì)胞在材料表面分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)后,細(xì)胞骨架的變化。
　

10、　 5、Real-time PCR法檢測CbfαⅠ、Ostenix、CollagenⅠ、OsteocalcinmRNA的相對表達(dá)。
　　 MG-63細(xì)胞接種到HA/TiO2、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層Ti片表面,分別培養(yǎng)1天、3天、7天后,收集細(xì)胞,提取總RNA,Real-time PCR法檢測CbfαⅠ、Osterix、CollagenⅠ、Osteocalcin mRNA的相對表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 一、

11、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的性能分析
　　 1、表面形貌分析涂層表面上的孔徑均勻,直徑在1-5μm,涂層表面沒有明顯的縫隙和裂紋;從截面形貌看,涂層結(jié)構(gòu)致密,厚度均勻,約為10μm,與Ti基體之間沒有明顯的界面。
　　 2、XRD結(jié)果分析所有復(fù)合涂層中均含有HA相,HA/TiO2組的HA的衍射強(qiáng)度最高,加入Zn2+以后ZnHA/TiO2-1,ZnHA/TiO2-2和ZnHA/TiO2-3組都有HA衍射峰,但是衍射強(qiáng)度比H

12、A/TiO2組明顯降低;而加入不同量的Zn2+,HA的衍射強(qiáng)度沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。
　　 3、Zn2+釋放濃度的測定隨著前體溶液中Zn/Ca摩爾比的增加,Zn2+的釋放濃度逐漸增加,并且遠(yuǎn)低于體外的細(xì)胞毒性濃度范圍。
　　 二、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的抗菌性能
　　 1、菌落計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)在HA/TiO2表面的P.gingivalis樣本稀釋液的瓊脂板上有大量的黑色菌落存在,而接種培養(yǎng)在ZnHA/TiO2表面

13、的P.gingivalis樣本稀釋液的瓊脂板上黑色菌落相對較少,且隨著Zn2+濃度增加,其菌落數(shù)量逐漸減少。
　　 2、菌體形態(tài)觀察在HA/TiO2涂層表面菌體形態(tài)規(guī)則,邊緣光滑呈球桿狀,為P.gingivalis的正常形態(tài)。在ZnHA/TiO2涂層表面菌體形態(tài)不規(guī)則,表現(xiàn)為拉長、彎曲、皺縮,呈長桿狀、凹陷狀、短桿狀和不規(guī)則狀,菌體大小差別較大。
　　 三、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層的生物相容性
　　 1、MTT

14、實(shí)驗(yàn)ZnHA/TiO2-1組與對照組HA/TiO2比較24h、48h、72h的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),而ZnHA/TiO2-2和ZnHA/TiO2-3組與對照組HA/TiO2比較24h、48h、72h的OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),實(shí)驗(yàn)組ZnHA/TiO2各組之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 2、PI單染法流式細(xì)胞儀分析在細(xì)胞接種48h后,在ZnHA/TiO2和HA/TiO2之問細(xì)胞在S

15、期和G2/M期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),但是在ZnHA/TiO2表面的細(xì)胞G0/G1期多于HA/TiO2對照組,細(xì)胞增殖指數(shù)ZnHA/TiO2也比HA/TiO2對照組增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3、掃描電鏡觀察在ZnHA/TiO2涂層的Ti表面,細(xì)胞鋪展在多孔的材料表面,向不同的方向伸展,呈多角形;細(xì)胞形態(tài)飽滿,分泌的細(xì)胞基質(zhì)多;可見分裂期細(xì)胞,細(xì)胞生長活躍;細(xì)胞伸出的絲狀偽足借助于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附

16、于材料表面,沿著材料的小孔周圍生長,與材料緊密黏附。而HA/TiO2涂層的Ti片表面,細(xì)胞呈圓形或者多角形,細(xì)胞伸展不明顯。
　　 4、免疫熒光觀察細(xì)胞在材料表面共培養(yǎng)24h后,HA/TiO2涂層的Ti表面成骨細(xì)胞呈球形或長梭形,細(xì)胞未在材料表面鋪展開,而ZnHA/TiO2的表面細(xì)胞多數(shù)呈多角形,細(xì)胞骨架隨著Zn2+成分的增加染色逐漸增強(qiáng),ZnHA/TiO2表面黏附的細(xì)胞與對照組比較數(shù)量明顯增多。48h組細(xì)胞已經(jīng)在ZnHA/Ti

17、O2材料表面形成了良好的鋪展,細(xì)胞骨架中的微絲、微管結(jié)構(gòu)清晰,順著細(xì)胞的伸展方向排列有序,細(xì)胞之間形成良好的交通。HA/TiO2材料表面的細(xì)胞微絲、微管結(jié)構(gòu)明顯減少,細(xì)胞形態(tài)略顯皺縮,在材料表面鋪展的面積較小,細(xì)胞之間沒有形成良好的交通。
　　 5、Real-time PCR法檢測CbfαⅠ、Osterix、CollagenⅠ、Osteocalcin mRNA的相對表達(dá)。
　　 MG-63細(xì)胞在ZnHA/TiO2表面與H

18、A/TiO2表面生長1,3和7天時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR骨相關(guān)基因表達(dá)的差異。CbfαⅠ mRNA在1天和7天時(shí)在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面升高,3天的時(shí)候降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。Osterix mRNA的表達(dá)在1天和3天時(shí)在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。ColⅠ mRNA的表達(dá)在ZnHA/TiO2表面7天時(shí)與HA/TiO2比較升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0

19、5)。Osteocalcin mRNA的表達(dá)在3天和7天時(shí)在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜O.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、ZnHA/TiO2復(fù)合涂層表面形成均勻、多孔的表面結(jié)構(gòu)。
　　 2、Zn2+釋放濃度低于毒性濃度范圍,并且隨著Zn/Ca摩爾比的增加Zn2+釋放濃度逐漸增加。
　　 3、Ti表面ZnHA/TiO2復(fù)合涂層具有抑制P.gingivalis生長

20、的作用。
　　 4、Ti表面ZnHA/TiO2復(fù)合涂層有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的性質(zhì)。
　　 5、Ti表面ZnHA/TiO2復(fù)合涂層有利于成骨細(xì)胞在其表面的黏附及細(xì)胞骨架的形成。
　　 6、Ti表面ZnHA/TiO2復(fù)合涂層促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子CbfαⅠ、Osterix mRNA的相對表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);促進(jìn)成骨細(xì)胞ColⅠ mRNA的相對表達(dá),降低Osteocalcin mRNA的相對表達(dá),差異有