新型復(fù)合生物抗菌敷料抗菌性能、吸濕能力及生物相容性研究.pdf

1、研究背景: 細(xì)菌感染是影響傷口愈合的主要因素之一，傷口滲出液里含有的大量的炎癥因子、蛋白酶和自由基都會(huì)減緩傷口的愈合速度。新型復(fù)合生物抗菌敷料的研發(fā)對(duì)治療外科感染傷口有重要的意義，是創(chuàng)傷敷料發(fā)展的必然趨勢(shì)。自從英國(guó)學(xué)者Wimter提出，傷口在濕潤(rùn)的環(huán)境下比干燥的環(huán)境下要愈合得快以來(lái)，使得人們對(duì)傷口愈合的過(guò)程有了新的認(rèn)識(shí)。如果創(chuàng)面皮膚局部浸漬，會(huì)降低宿主抵御微生物侵襲的防御屏障，另一方面，在干燥條件下，細(xì)胞的活動(dòng)將受到抑制，會(huì)形成痂，并進(jìn)

2、一步發(fā)生組織壞死的可能，影響傷口愈合。對(duì)創(chuàng)面敷料的基本要求是:具有一定的透水透氣性，較少熱量和電解質(zhì)的損失，減少蛋白質(zhì)的丟失，加速傷口的愈合，降低疼痛的感覺(jué)，無(wú)毒性，無(wú)抗原性，有廣泛的適用性，而且價(jià)格低廉。隨著醫(yī)學(xué)生物工程及組織生物學(xué)的發(fā)展，目前認(rèn)為理想的創(chuàng)面敷料還應(yīng)具備以下功能:①能吸收多余的滲出物，與傷口接觸面保持一定濕度;②具有良好的易成凝膠性、粘附性及生物相容性;③移去敷料時(shí)不會(huì)造成傷口二次損傷，具有良好的生物降解性;④具有一定

3、的抗菌性;⑤防止微生物、有害微粒及其他有害物質(zhì)污染傷口;⑥制作及降解過(guò)程不會(huì)造成環(huán)境污染。國(guó)內(nèi)有報(bào)道稱慢性傷口初期選擇現(xiàn)代抗感染性敷料，能有效的對(duì)傷口局部抗感染和引流。
　　 海藻酸鹽是海洋生物資源之一，因其儲(chǔ)量豐富、可再生及沒(méi)有二次污染而被選擇成為人類未來(lái)理想的生物資源。海藻酸鈉具有很好的凝膠特性，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域，顯示出良好的發(fā)展前景。藻酸鈉是可溶于水的明膠樣碳水化合物，在其水溶液中加入二價(jià)陽(yáng)離子作用

4、下可發(fā)生聚合反應(yīng)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液混合，形成藻酸鈣，交聯(lián)過(guò)程均勻，具有良好的通透性，利于大分子通過(guò)，有利于其中的種子細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞;其制備方法溫和，形成的凝膠具有多孔狀結(jié)構(gòu)。以海藻酸鹽為原料研發(fā)的海藻纖維具有無(wú)毒性、高吸水成凝膠性、高透氧性、良好的生物相容性、整體易去除性、良好的生物降解吸收性、止血性能、能促進(jìn)傷口愈合、高離子吸附性等優(yōu)越特性，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究。藻酸鈣在體內(nèi)以酶解方式

5、降解，在體內(nèi)降解時(shí)間報(bào)道不一致，但藻酸鈣具有完全降解性。早在1951年，Blaine等就探討了使用海藻酸作為手術(shù)中的可吸收止血材料的可能性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)海藻酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有抑制作用。藻酸生物敷料從天然海藻中提取，加工過(guò)程中使用的材料沒(méi)有任何毒性，因而海藻酸纖維生物敷料對(duì)人體無(wú)毒[12]。海藻酸能夠維持創(chuàng)面一個(gè)濕潤(rùn)的環(huán)境，有利于創(chuàng)面愈合和皮膚再生.海藻酸生物敷料止血性能良好，能很好地降低傷口的疼痛，另外其成本也比較低。
　　 銀離子因其

6、抗菌能力強(qiáng)、細(xì)菌耐藥發(fā)生率低被選用作抗菌材料已有悠久的歷史，銀被認(rèn)為具有廣譜的抗菌活性[13]，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、部分病毒等均有抗菌作用[14]，甚至對(duì)耐藥菌株都顯示出很強(qiáng)的抗菌作用[15]。研究表明銀粒子不僅具有抗炎特性還有止痛作用[16-17]，能抑制DNA的復(fù)制，具有很強(qiáng)的滲透性，能滲透到皮下組織，與切口接觸后迅速持久地釋放納米銀粒子，快速有效地殺滅切口及縫線上的病原體。目前大量耐藥菌的發(fā)生和增長(zhǎng)促進(jìn)銀再次被作為

7、抗菌劑應(yīng)用，銀化合物由于其廣泛殺菌活性和抗炎作用被用作創(chuàng)面的治療[18]。添加銀離子的海藻酸敷料表現(xiàn)較強(qiáng)的出快速殺菌能力，可用于感染傷口的局部控制細(xì)菌繁殖。目前已有國(guó)內(nèi)外多家生產(chǎn)企業(yè)推出的納米銀醫(yī)用抗菌敷料是將納米銀附著于醫(yī)用脫脂紗布或醫(yī)用非織造布敷料。
　　 廣東省百合醫(yī)療科技有限公司研發(fā)添加納米銀海藻酸鈣纖維的新型復(fù)合生物抗菌敷料，該敷料研發(fā)對(duì)防治外科傷口感染、促進(jìn)慢性傷口愈合、減輕傷口的炎癥反應(yīng)、減少患者的不適感、縮短患者

8、的住院時(shí)間及減輕治療負(fù)擔(dān)等有重大的意義。與此同時(shí)，添加納米銀海藻酸鈣纖維的新型復(fù)合生物抗菌敷料的抗菌性能及生物毒性檢測(cè)對(duì)保證其安全有效的應(yīng)用極為重要。
　　 目的:研制添加納米銀海藻酸鈣纖維的新型復(fù)合生物抗菌敷料，并充分評(píng)價(jià)其抗菌性能、吸濕性能及其在體內(nèi)外的生物相容性，為其作為優(yōu)質(zhì)敷料進(jìn)一步應(yīng)用于防治外科感染傷口、促進(jìn)傷口愈合提供最佳的選擇。
　　 方法:
　　 1、添加納米銀海藻酸鈣纖維的新型復(fù)合生物抗菌敷料的

9、制備。濕法紡絲制得納米銀藻酸鹽纖維，再經(jīng)無(wú)紡布工藝紡制成納米銀藻酸鹽敷料:納米銀溶液通過(guò)攪拌、超聲波均勻分散于水中，邊高速攪拌邊加入海藻酸鈉至形成粘稠溶液，脫泡過(guò)濾后通過(guò)噴絲孔擠出到含有鈣離子的凝固浴中，形成固態(tài)納米銀海藻酸鈣纖維長(zhǎng)絲。該長(zhǎng)絲經(jīng)過(guò)拉伸、水洗、脫水干燥、卷曲形成纖維;纖維可梳理成網(wǎng)而制成非織造布，還可經(jīng)過(guò)針刺使纖維互相交纏而增加強(qiáng)力。
　　 2、新型復(fù)合生物抗菌敷料體外抗菌性能的研究。本研究采取貼膜法檢測(cè)新型復(fù)合生

10、物抗菌敷料對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抗菌性能，并將新型復(fù)合生物抗菌敷料與添加銀離子的海藻酸鈣敷料和單純海藻酸鈣敷料的抗菌性能作比較。將標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌傳代培養(yǎng)，混懸于TSB培養(yǎng)液中，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲贸蓾舛葹?.5×108 CFU/mL的菌液，并依次做2次10倍遞增稀釋。分別吸取200μL菌液接種在各組抗菌試件表面（每種敷料做五個(gè)平行標(biāo)本），蓋上消毒PE膜，培養(yǎng)24 h。24h后取出培養(yǎng)的樣品，分別加入洗脫液2

11、0mL，反復(fù)洗各組受試樣品的覆蓋膜（用鑷子夾起薄膜沖洗），旋渦振蕩1min充分搖勻后，取200μl接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)中，在(37士1)℃下培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)CFU。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果取平均值。
　　 3、新型復(fù)合生物抗菌敷料體外吸濕性能的研究稱取8.3 g的氯化鈉和0.277 g的無(wú)水氯化鈣，溶于1L的蒸餾水中配制成英國(guó)藥典規(guī)定的A溶液。在測(cè)試敷料的吸液率時(shí)，把三種敷料分別裁成5 cm×5 cm尺寸后放置24

12、h，使纖維的回潮率達(dá)到平衡。這時(shí)測(cè)定敷料的初始質(zhì)量為W。稱取比敷料重40倍的A溶液，分別將溶液和敷料對(duì)應(yīng)放置在2個(gè)直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在37℃下放置30 min后用鑷子夾住敷料的一角在空中，掛30s后稱取敷料的濕質(zhì)量(W1)。單位質(zhì)量敷料的吸液率=(W1-W)/W(g/g)，單位面積的吸液率=4(W1-W)g/100 cm2。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，求其平均值。
　　 測(cè)試液體在纖維內(nèi)和纖維之間的分布時(shí)，把吸液后的敷料（質(zhì)量為W

13、1）用紗布分別包扎起來(lái)放在脫水機(jī)中脫水15min后，測(cè)定脫水后敷料的質(zhì)量為W2，這個(gè)質(zhì)量是纖維本身的干質(zhì)量和吸收進(jìn)纖維內(nèi)部的液體質(zhì)量的總和。然后把離心脫水后的敷料在105℃干燥4h，試樣至恒質(zhì)量后測(cè)得纖維的干質(zhì)量W3。W1-W2是吸收在纖維之間的液體，而W2-W3是吸收進(jìn)纖維內(nèi)部的液體。(W1-W2)/W3和(w2-w3)/w3能分別計(jì)算出每克干質(zhì)量的敷料吸收到纖維之間和纖維內(nèi)部的液體。
　　 4、按國(guó)家GB/T16886-20

14、08和IS010993.12-2009中的一系列標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)制備的添加納米銀的新型復(fù)合生物抗菌敷料進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)，以綜合評(píng)價(jià)其生物相容性，并與添加銀離子的海藻酸鈣敷料和單純海藻酸鈣敷料的生物相容性作比較。
　　 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):將實(shí)驗(yàn)組（（添加納米銀的新型復(fù)合生物抗菌敷料浸提液）、陰性對(duì)照組(2％小牛血清RPMI1640)與陽(yáng)性對(duì)照組（（5％的二甲基亞砜）各3ml，分別置于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入4x

15、104/ml L-929細(xì)胞懸液3ml，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5％C02的培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)72h后，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。將200ul濃度為4×104/mL的L-929細(xì)胞懸液接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，同樣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄原液后分別加入實(shí)驗(yàn)組（添加納米銀的新型復(fù)合生物抗菌敷料浸提液、添加銀離子的海藻酸鈣敷料浸提液和單純海藻酸鈣敷料浸提液）、陰性對(duì)照組(2％小牛血清RPMI1640)與陽(yáng)性對(duì)照組（5％的二甲基亞砜）各

16、200μl，每種提取液重復(fù)4孔/板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。并采用MTT比色法測(cè)定L-929細(xì)胞培養(yǎng)72h的相對(duì)增殖率(RGR)，評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性。
　　 將實(shí)驗(yàn)組三種浸提液分別用2％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)75％，50％，25％，10％，1％梯度稀釋，然后分別取200μL的實(shí)驗(yàn)組浸提液各自的各種濃度的稀釋液重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，同樣采用2％小牛血清RPMI1640為陰性對(duì)照組與5％的二甲基亞砜為

17、陽(yáng)性對(duì)照組，采用MTT比色法測(cè)定L-929細(xì)胞培養(yǎng)72h的相對(duì)增殖率(RGR)，評(píng)價(jià)材料被稀釋后的細(xì)胞毒性變化。
　　 急性全身毒性實(shí)驗(yàn):按50ml/kg劑量標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)菌條件下將添加納米銀的新型復(fù)合生物抗菌敷料浸提液注入試驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)，陰性對(duì)照組注入生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注入苯酚。給藥后連續(xù)7天觀察小鼠，記錄小鼠呼吸、進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)等一般情況、毒性反應(yīng)、體重變化或死亡。
　　 溶血實(shí)驗(yàn):取10ml受試樣品浸提液（添加納米銀的新

18、型復(fù)合生物抗菌敷料浸提液）、10ml生理鹽水（陰性對(duì)照組）、10ml蒸餾水（陽(yáng)性對(duì)照組），分別加入0.2ml的新鮮抗凝稀釋兔血，肉眼觀察是否出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象;酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本上清液的吸光度，評(píng)價(jià)受試材料的體外血液相容性。
　　 5、通過(guò)掃描電鏡，觀察新型復(fù)合生物抗菌敷料的微觀結(jié)構(gòu)將已滅菌的新型復(fù)合生物抗菌敷料與添加銀離子的海藻酸鈣敷料和單純海藻酸鈣敷料分別裁剪成1cm×1cm大小正方形，經(jīng)高壓滅菌后用戊二醛及鋨酸雙固定標(biāo)本，以

19、金屬鍍膜法把鉑蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面將樣品標(biāo)本放在掃描電鏡下觀察各自的顯微結(jié)構(gòu)，主要檢測(cè)敷料在電鏡下銀離子和納米銀的形態(tài)及分布情況。
　　 將裁剪成1cm×1cm大小的實(shí)驗(yàn)樣品分別放進(jìn)已經(jīng)滴入0.2 mL濃度為1.5×106cfu/mL的金黃色葡萄球菌(ATCC29213)菌液的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，然后將滅菌培養(yǎng)試管放置在(37士1)℃、相對(duì)濕度大于90％條件下培養(yǎng)24h。24h后用無(wú)菌鑷子取出樣品敷料，檢測(cè)細(xì)菌在

20、各敷料上的分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、新型復(fù)合生物抗菌敷料體外抗菌性能評(píng)價(jià)新型納米銀海藻酸鈣敷料對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑菌率分別為99.7％和99.7％，含銀離子的海藻酸鈣敷料對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑菌率分別為97.8％和97.0％，海藻酸鈣敷料對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑菌率分別為84.9％和84.4％。體外抗菌實(shí)驗(yàn)提示3種海藻酸鈣敷料均金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有一定的抑菌能力，新型納

21、米銀海藻酸鈣敷料在抑制和殺滅金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌中有明顯的優(yōu)勢(shì)。組間比較有明顯的差異，新型納米銀海藻酸鈣敷料對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有顯著的抗菌效能。
　　 2、新型復(fù)合生物抗菌敷料體外吸濕性能的評(píng)價(jià)在對(duì)新型復(fù)合生物抗菌敷料、添加銀離子的海藻酸鈣敷料和單純海藻酸鈣敷料三種材料進(jìn)行離心脫水及干燥后發(fā)現(xiàn)，海藻纖維本身具有良好的吸水性，所吸收的水分中一大部分能被保留在纖維內(nèi)部，很難通過(guò)離心脫水去除，添加了銀離子或納米銀

22、的海藻酸鈣敷料并沒(méi)有影響敷料的吸濕率。
　　 3、新型復(fù)合生物抗菌敷料的生物相容性評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):新型復(fù)合生物抗菌敷料和單純海藻酸鈣敷料浸提液的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，折光性較強(qiáng)，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞脫落、裂解等細(xì)胞病變情況，72h后RGR分別為90.5％，95.7％，兩組細(xì)胞毒性反應(yīng)均為Ⅰ級(jí);添加銀離子的海藻酸鈣敷料浸提液作用小鼠成纖維細(xì)胞72h后RGR為36.1％，細(xì)胞毒性反應(yīng)均為Ⅲ級(jí)。提示海藻酸鈣敷料及添加納米銀的新型復(fù)合生

23、物抗菌敷料都具有良好的細(xì)胞相容性，無(wú)細(xì)胞毒性:添加銀離子的海藻酸鈣敷料具有一定的細(xì)胞毒性，并提示而只有當(dāng)含銀離子海藻酸鈣敷料浸提液稀釋到原溶液的四分之一時(shí)，72h后RGR為78.1％，才顯示出較低的細(xì)胞毒性。
　　 急性全身毒性實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組的小鼠在注射浸提液后，進(jìn)食、呼吸、活動(dòng)、排泄均未發(fā)現(xiàn)異常，在七天的觀察期里，小鼠體重呈增加的趨勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)驚厥、步態(tài)不穩(wěn)、狂躁等毒性反應(yīng)，也沒(méi)有出現(xiàn)死亡病例。
　　 溶血實(shí)驗(yàn):受試材料的

24、浸提液沒(méi)有引起體外溶血反應(yīng)，新型復(fù)合生物抗菌敷料的溶血率分別為1.41％。
　　 4、通過(guò)掃描電鏡，觀察新型復(fù)合生物抗菌敷料的微觀結(jié)構(gòu)新型納米銀海藻酸鈣敷料內(nèi)的納米銀粒子呈較規(guī)則球形，平均粒徑較小，均勻地分布在海藻酸纖維之間的孔隙中。銀離子海藻酸鈣敷料的微觀結(jié)構(gòu)，銀粒子顆粒大，平均粒徑可達(dá)1μm，且形狀及分布不如納米銀形狀規(guī)則。新型復(fù)合生物抗菌敷料中僅有少量細(xì)菌零星地分布在纖維上;添加銀離子的海藻酸鈣敷料有少量細(xì)菌分布在纖維上，

25、部分細(xì)菌落形成條索狀分布，但在纖維間并沒(méi)有形成鏈接的細(xì)菌條索;單純海藻酸鈣敷料可以看到一層薄薄的細(xì)菌生物膜分布在纖維上，而且在纖維之間形成細(xì)菌膜的連接。
　　 結(jié)論:
　　 1、本課題用濕法紡絲制得納米銀藻酸鹽纖維，再經(jīng)無(wú)紡布工藝紡制成新型復(fù)合生物抗菌敷料。并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該新型敷料具備較強(qiáng)的抗菌性能、高吸濕凝膠性和優(yōu)異的生物相容性。
　　 2、根據(jù)QB/T2591-2003規(guī)定材料對(duì)微生物的抑菌率＞90％才

26、能被稱為抗菌材料，通過(guò)平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該新型復(fù)合生物敷料表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌性能，而且通過(guò)掃描電鏡觀察，該新型復(fù)合生物抗菌敷料的納米銀離子在海藻酸鈣纖維上分布均勻，抗菌性能比海藻酸鈣纖維及添加銀離子的海藻酸鈣纖維強(qiáng)。
　　 3、海藻酸纖維具有良好的吸濕能力，在往海藻酸鈣纖維中添加納米銀制成新型復(fù)合生物抗菌敷料后，并沒(méi)有影響海藻酸鈣纖維的吸濕能力，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該新型復(fù)合生物敷料具備較強(qiáng)的吸濕能力，與海藻酸鈣纖維相當(dāng)(P＞0.05)。