應用短發(fā)夾狀RNA沉默NF-κB基因促進肝星狀細胞凋亡機制研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)發(fā)生的中心事件是由于肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活，細胞外基質(extracellullar matrix，ECM)生成過多、降解相對不足，在肝內大量沉積，而I型膠原占沉積ECM的70％以上。在HF恢復期，HSC凋亡明顯增多，一方面消除了ECM的來源，另一方面也解除了金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloprot

2、einase，TIMP)對基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的抑制作用，從而促進胞外基質的降解。因此，誘導活化HSC凋亡可使HF發(fā)生逆轉。 NF-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)在多種細胞中高表達，不同的Rel/NF-κB家族成員可以結合成不同的二聚體。在這些二聚體中，最常見的形式是由p50和p65組成的異源二聚體。在絕大多數靜止期的細胞中，NF-κB與

3、其抑制物IκB(the inhibitor of κB，IκB)蛋白相結合，以非活性形式存在于細胞質中。NF-κB可以被多種刺激物所激活，如TNF-α、IL-1、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等，這些刺激物可以通過對IκB的磷酸化而使其降解，并與NF-κB解離，暴露NF-κB的核識別位點，使其進入核內，促進下游的靶基因的轉錄。 NF-κB的激活在細胞生存、黏附、分化和細胞生長中起關鍵作用。而且，活化的NF

4、-κB信號通路通過上調其下游的靶基因如COX2、cyclinD1、bcl-2等，抑制細胞的凋亡。并且實驗發(fā)現NF-κB的激活通過阻止Caspase-8的激活抑制了Caspase的起始，從而抑制了Caspase-3的激活，進一步抑制細胞的凋亡。研究表明，在靜止態(tài)HSC中NF-κB并無活性，但在激活態(tài)HSC中，活性卻持續(xù)存在，因此有理由相信NF-κB可能通過抑制HSC的凋亡而使活化的HSC數量維持在相當的水平，最終導致肝纖維化的發(fā)生。NF-

5、κB的這一特性，使得這個轉錄因子成為一個有前途的分子靶點。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術是目前研究基因功能強有力的工具之一，能夠用于研究特定基因的表達抑制。迄今為止，NF-κB參與多種炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡等病理、生理過程的調控已見較多報道，但NF-κB在肝纖維化及HSC增殖、凋亡中的作用報道甚少。為此，本研究應用體外細胞培養(yǎng)技術，以LPS激活NF-κB，利用RNAi技術特異性的抑制NF-κB亞單位p65

6、的表達，研究活化的NF-κB表達受到抑制后，對HSC凋亡的影響及其可能機制，抑制肝纖維化作用。 目的：應用p65shRNA轉染HSC，探討p65shRNA對NF-κB表達的影響，以及對HSC凋亡的影響及其可能機制。 方法：應用含2％胎牛血清、100IU·ml-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1mol·L-1HEPES的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)HSC。應用RNAi技

7、術特異性的抑制NF-κB亞單位p65的表達，通過熒光顯微鏡篩選出熒光素標記的對照shRNA在HSC中轉染效率最高的最佳濃度和作用時間；Western blotting方法檢測HSC中p65及其下游抗凋亡蛋白bcl-2的表達；采用流式細胞儀、TUNEL染色及DNA ladder法檢測p65shRNA對HSC凋亡的影響；采用Caspase-3活性試劑盒檢測p65shRNA對Caspase-3活性的影響；明膠酶譜法測定明膠酶的活性；RT-PC

8、R共擴增技術檢測I型前膠原mRNA表達。 結果：①shRNA轉染HSC的效率：將熒光素標記的對照shRNA轉染HSC，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率，結果顯示200pmol shRNA組轉染72h效率最高，可達90％以上。②p65shRNA轉染HSC后對NF-κB阻斷作用：Western blot結果表明，LPS作用于HSC后，p65蛋白表達量顯著高于空白對照組(2.34±0.26 vs 0.61±0.11)，升高了227.42％，

9、P＜0.01；但與脂質體組、陰性對照組比較無明顯差異，P＞0.05。p65shRNA轉染HSC 72h后，p65蛋白表達量顯著降低(0.27±0.09 vs 2.19±0.26)，較陰性對照組降低87.67％，經統計學處理有顯著性差異，P＜0.01。③p65shRNA對HSC凋亡的影響：流式細胞儀和TUNEL染色法測定均顯示：經LPS處理后，LPS組、脂質體組與陰性對照組間無組間差異，P＞0.05，均低于空白對照組，P＜0.05；p65

10、shRNA轉染HSC 72h后，與空白對照組、LPS組、脂質體組與陰性對照組相比，可明顯促進細胞的凋亡。表明在LPS激活NF-κB后，抑制HSC凋亡，Np65shRNA轉染組特異性抑制NF-κB表達后，可有效的促進細胞凋亡。DNA ladder檢測p65shRNA轉染組出現梯狀條帶，也表明p65shRNA轉染HSC 72h后，可促進細胞的凋亡。④p65shRNA阻斷NF-κB信號通路下調bcl-2的表達：Western blot結果表明

11、，LPS作用于HSC后，bcl-2蛋白表達量顯著高于空白對照組(1.80±0.07 vs 0.59±0.11)，升高了205.08％，P＜0.05；但與脂質體組、陰性對照組比較無明顯差異，P＞0.05。p65shRNA轉染HSC 72h后，bcl-2蛋白表達量顯著降低(0.31±0.14 vs 1.17±0.06)，較陰性對照組降低81.87％，經統計學處理有顯著性差異，P＜0.01。表明在LPS激活NF-κB后，促進其下游調控基因bc

12、l-2的表達，而p65shRNA轉染組特異抑制NF-κB表達后，可下調bcl-2的蛋白表達。⑤p65shRNA阻斷NF-κB信號通路激活Caspase-3活性：Caspase-3活性檢測顯示：經LPS處理后，LPS組、脂質體組與陰性對照組間無組間差異，P＞0.05；均低于空白對照組，P＜0.05；p65shRNA轉染HSC 72h后，與空白對照組、LPS組、脂質體組與陰性對照組相比，可明顯增高Caspase-3活性，P＜0.01。表明在

13、LPS激活NF-κB的表達后，Caspase-3活性受抑；而p65shRNA轉染組特異抑制NF-κB表達后，可有效的激活Caspase-3活性。⑥p65shRNA阻斷NF-κB信號通路增強明膠酶活性：明膠酶譜法測定：p65shRNA轉染HSC 72h后，與空白對照組、LPS組、脂質體組與陰性對照組相比，可明顯增高明膠酶活性，P＜0.01。表p65shRNA轉染組特異抑制NF-κB表達后，可有效的增強明膠酶活性。⑦p65shRNA阻斷NF

14、-κB信號通路后下調I型前膠原表達：RT-PCR共擴增檢測I型前膠原和內參GAPDH基因表達，掃描結果分析顯示：p65shRNA轉染HSC 72h后，與空白對照組、LPS組、脂質體組與陰性對照組相比，I型前膠原表達明顯降低，有明顯統計學意義，P＜0.01。 結論：RNA干擾技術是研究基因功能的強有力的手段之一，p65shRNA可以特異性的阻斷NF-κB基因表達；可以促進HSC的凋亡，其機制可能與下調NF-κB下游基因中抗凋亡蛋白