珍珠層人工骨骨誘導作用及相關機制實驗研究.pdf

1、近年來，珍珠層(nacre)作為一種新型骨生物替代材料受到了更多的關注。珍珠層來源于海洋中軟體動物雙殼類珍珠貝科或蚌科動物的貝殼內(nèi)層，其組成成分主要為文石型碳酸鈣，并含有少量有機質(zhì)和微量金屬元素。我們前期研究表明：珍珠層人工骨能夠促進兔橈骨長節(jié)段骨缺損的修復：在犬腰椎橫突間骨融合及兔顱骨缺損的修復實驗中均觀察到明顯的成骨作用。珍珠層人工骨具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、骨傳導性和較好的成骨作用。珍珠層作為生物骨替代材料，與其

2、他無機生物材料相比，其優(yōu)勢在于含有具有誘導成骨作用的功能成分?；诖?，本研究從珍珠層中提取水溶性物質(zhì)，通過細胞學及體內(nèi)動物實驗，探討其對骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow derived stromal cells，BMSCs)向成骨細胞方向分化的作用及相關機制，并研究珍珠層水溶性提取物(water soluble matrix of nacre powder，WSM)與血小板衍生生長因子(platelet-derived growt

3、h factor BB，PDGF-BB)協(xié)同作用下的骨誘導作用，旨在探討珍珠層人工骨骨誘導作用及相關機制。同時開展珍珠層人工骨與人骨髓基質(zhì)細胞的相容性研究，為進一步臨床應用研究奠定基礎。 目的： 1．探討WSM誘導人BMSCs成骨性分化的作用及機制，以及PDGF-BB在此過程中的協(xié)同作用。 2．建立成骨細胞-骨髓基質(zhì)細胞復合培養(yǎng)體系，探討共育體系中兩種細胞的生物學特性及WSM對于復合培養(yǎng)體系生物學行為的影響。

4、 3．觀察WSM誘導的大鼠骨髓基質(zhì)細胞與珍珠層人工骨復合后在大鼠肌袋內(nèi)的異位成骨作用，進一步明確珍珠層人工骨的骨誘導作用。 4．研究珍珠層人工骨與入骨髓基質(zhì)細胞的生物相容性。 方法： 1．體外分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細胞(hBMSCs)，利用形態(tài)學、測定細胞生長曲線、HE染色、Giemsa染色及流式細胞術等方法對hBMSCs進行鑒定。 2．低溫狀態(tài)下提取珍珠層粉(馬氏珍珠貝)中的水溶性物質(zhì)(WSM)，利用真

5、空冷凍干燥技術將其濃縮。不同濃度作用于hBMSCs，檢測堿性磷酸酶活性，制定劑量．效應曲線，確定最佳作用濃度。 3．WSM及PDGF-BB作用于體外培養(yǎng)的第3代的hBMSCs，以地塞米松誘導培養(yǎng)基為陽性對照，利用流式細胞術檢測WSM對hBMSCs細胞周期的影響。誘導后的不同時間點，分別采用Gormori法堿性磷酸酶(AKP)染色、茜素紅鈣化結節(jié)染色等方法評價WSM、PDGF-BB誘導hBMSCs成骨性分化的效能；同時采用One-

6、step RT-PCR方法檢測hBMSCs誘導前后骨形成蛋白(BMP-2)、轉化生長因子(TGF-B1)、核心結核因子(Cbfa-1)等生長因子表達差異。 4．原代分離hBMSCs和人成骨細胞(OBs)，將2種細胞置于Transwell共育環(huán)境中共同培養(yǎng)，建立hBMSCs-OBs共育體系。分別采用MTT、丫啶橙染色、AKP活性檢測等方法初步評價共育體系中兩種細胞增殖、凋亡及功能改變情況。WSM作用于共育體系，不同時間點利用One

7、-step RT-PCR方法檢測共育體系中hBMSCs細胞BMP-2、AKP、TGF-β1、Cbfa-1、Osteoncction、Osteocalcin、Osteopontin等成骨標志基因表達情況，判斷WSM對共育體系中hBMSCs成骨性分化的誘導作用。 5．分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)細胞(rBMSCs)，將rBMSCs種植于珍珠層人工骨材料上，利用WSM體外誘導培養(yǎng)7天后，植入3月齡SD大鼠背部肌袋內(nèi)，分別以復合未誘導rBM

8、SCs、單純珍珠層人工骨材料作對照。于植入后1d、4、8和12周時行X線攝片，觀察WSM誘導的rBMSCs-人工骨材料復合物在大鼠體內(nèi)異位成骨情況。在4、8和12周取材，經(jīng)大體觀察、組織學和免疫組織化學染色方法檢測異位成骨情況。 6．將hBMSCs與珍珠層人工骨材料及WSM共同培養(yǎng)，用倒置顯微鏡、考馬斯亮藍染色法、四唑鹽(MTT)比色法、掃描電鏡等方法，研究珍珠層人工骨與hBMSCs生物相容性。 結果： 1．hB

9、MSCs細胞剛貼壁時呈三角形、圓形、紡綞形或多角形等不規(guī)則形狀。傳代后形成單層時呈典型的漩渦式生長。生長曲線呈“S”形。hBMSCs表達CD29、CD44、和CDl05為陽性，而CD45、CD34表達為陰性。 2．WSM初提液經(jīng)真空冷凍干燥方法濃縮至30mg/ml，不同濃度作用于hBMSCs。結果表明100μg/ml以下的WSM對hBMSCs的AKP活性影響不大，當達到15μg/ml時作用效果最顯著，之后再增加濃度作用無明顯增加

10、，因此確定15μg/ml的WSM為本研究的實驗濃度。 3．hBMSCs誘導后第3d及第7d，WSM組、PDGF-BB+WSM及誘導培養(yǎng)基組的AKP染色均為陽性，第7d時更為明顯；而空白對照組及PDGF-BB組則僅見極少數(shù)的AKP染色弱陽性細胞，未見典型的AKP陽性細胞。hBMSCs誘導后第18天，誘導培養(yǎng)基組茜素紅染色可見典型同心圓狀的紅色鈣化結節(jié)；WSM組形成不成熟的鈣化結節(jié)，較為典型；PDGF-BB+WSM組形成的鈣化結節(jié)數(shù)

11、量較多，體積?。豢瞻讓φ战M及PDGF-BB組未見明顯鈣化結節(jié)形成。 4．骨髓基質(zhì)細胞．成骨細胞共育體系能夠促進OBs的增殖與AKP的活性，同時抑制BMSCs的凋亡，促進BMSCs的趨化聚集。培養(yǎng)第7天，共育體系能夠提高hBMSCs的BMP-2、AKP、Cbfa-1、TGF-β1基因的表達(P<0.05)；WSM能夠使共育體系中hBMSCs的BMP-2、AKP表達進一步提高(P<0.05)；而WSM對Cbfa-1、TGF-β1、C

12、ollage-1、Osteonectin等基因表達無影響(P>0.05)。 5．復合WSM誘導后rBMSCs的人工骨植入大鼠肌袋內(nèi)發(fā)生異位成骨：8周時有類骨質(zhì)形成，12周時材料中出現(xiàn)較為成熟的板層樣骨組織，其中可見小梁骨；復合rBMSCs的對照組12周僅有少量不規(guī)則小梁骨形成；單純材料組僅見纖維結締組織及肌肉組織長入材料，未見成骨發(fā)生。X線檢查，組內(nèi)比較，WSM+rBMSCs+人工骨組12周時材料的X線阻射密度值與4周時相比有統(tǒng)

13、計學差異(P<0.05)，其余兩組各時間點無差異。組間比較，WSM+rBMSCs+人工骨組12周時阻射密度值高于其他兩組，余未見差異(P>0.05)。 6．MTT法顯示隨培養(yǎng)時間的延長，珍珠層人工骨材料對hBMSCs生長與增殖無影響(各時間點P>0.05)。掃描電鏡顯示hBMSCs可在珍珠層人工骨材料表面良好生長，增殖并分泌基質(zhì)，WSM能夠促進hBMSCs總蛋白表達。 結論： 1．WSM能夠誘導體外培養(yǎng)的hBMS

14、Cs的成骨性分化，PDGF-BB在此過程中具有協(xié)同效應，而PDGF-BB單獨作用時無骨誘導作用。 2．BMSCs-OBs共育體系能夠促進OBs的增殖及堿性磷酸酶的表達，降低hBMSCs的凋亡，促進hBMSCs的趨化聚集，提高hBMSCs的BMP-2、TGF-β1等因子的表達。 3．WSM能夠促進BMSCs-OBs共育體系內(nèi)OBs分化，提高hBMSCs的BMP-2、AKP等基因表達。WSM對OBs的成熟及BMSCs的成骨性