Ad-BMP2基因轉(zhuǎn)染肌衛(wèi)星細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．探討GFP轉(zhuǎn)基因鼠咀嚼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離，鑒定及體外培養(yǎng)方法，研究其生物學(xué)特性及體外細(xì)胞培養(yǎng)傳代對(duì)咀嚼肌衛(wèi)星細(xì)胞GFP熒光保持的影響，從而探討GFP轉(zhuǎn)基因鼠咀嚼肌衛(wèi)星細(xì)胞移植入野生型小鼠后是否可以作為追蹤細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的有效方法。 2．研究腺病毒介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SMSCs)后經(jīng)體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為成骨樣細(xì)胞的能力，探討骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞的可能性。 3．觀察腺

2、病毒介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞后體內(nèi)骨誘導(dǎo)能力及骨缺損修復(fù)能力。 方法： 1．取10只新生三日齡綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠面部咀嚼肌，采用酶消化法分離出咀嚼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞，體外進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，建立了一個(gè)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞系。通過(guò)倒置顯微鏡觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定等指標(biāo)來(lái)研究咀嚼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化能力，通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP熒光的保持及表達(dá)。MTT法對(duì)不同濃度的FBS

3、，不同接種密度及不同濃度的IGF-1對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)增值中的作用進(jìn)行測(cè)定。利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行骨骼肌肌動(dòng)蛋白，結(jié)蛋白鑒定，DAPI進(jìn)行細(xì)胞核的標(biāo)記檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的純度。 2．將分離出的SMSCs，進(jìn)行體外原代及傳代培養(yǎng)后，經(jīng)腺病毒介導(dǎo)的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)轉(zhuǎn)染，通過(guò)倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)，應(yīng)用改良Gomori氏鈣鈷法顯示堿性磷酸酶的ALP活性(組織化學(xué)染色方法)及生物化學(xué)方法進(jìn)行定量檢測(cè)

4、、免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行骨鈣素及I型膠原的檢測(cè)，ELISA方法進(jìn)行骨鈣素含量測(cè)定，western blot方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BMP-2蛋白表達(dá)檢測(cè)并進(jìn)行體外礦化能力的測(cè)定。 3．將轉(zhuǎn)染BMP-2基因的肌衛(wèi)星細(xì)胞吸收到膠原支架上，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察異位骨誘導(dǎo)能力及骨缺損修復(fù)能力。129sv小鼠45只，,體重24-30g，年齡6-8周。其中 15R 129sv小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，麻醉后將細(xì)胞膠原支架復(fù)合物移植入野生型svl

5、29小鼠的后小腿肌肉中，術(shù)后2、3及4周取出標(biāo)本，進(jìn)行X線片觀察，組織學(xué)觀察及熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨能力；別外30只 129sv小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2大組，每大組15只，每大組又分成3小組，每小組5只。麻醉后在野生型129 sv小鼠顱頂骨上制作5mm的骨缺陷，將細(xì)胞膠原支架復(fù)合物移植入野生型129sv小鼠顱頂骨缺陷中，術(shù)后2、3及4周各組處死5只取出標(biāo)本，進(jìn)行軟X線觀察及激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)骨缺陷的修復(fù)能力。