黃芩苷和黃芩素的抗炎和免疫調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景:
　　 黃芩苷(Baicalin)及其苷元黃芩素(Baicalein)是從黃芩根中分離的黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用，其中以抗炎和免疫調(diào)控作用尤為突出。在多種炎癥和自身免疫性動(dòng)物模型上黃芩苷顯示明確的抗炎和免疫調(diào)控作用，這些模型包括：急性胰腺炎，哮喘，急性肺損傷，急性肝損傷，肝纖維化，實(shí)驗(yàn)性牙周炎，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎等。黃芩苷體內(nèi)給藥一般可以減輕組織炎癥性損傷，下調(diào)模型動(dòng)物血漿促炎細(xì)胞因子水平(TNF-α、I

2、L-1、IL-6等)，并可以調(diào)節(jié)某些免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如抑制哮喘模型動(dòng)物的脾細(xì)胞分泌IL-4和IL-5，增加IL-10；抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IFN-γ，但增加IL-4分泌。體外實(shí)驗(yàn)表明：黃芩苷對刀豆蛋白(ConA)、佛波醇酯(PMA)/離子霉素(ionomycin)、或內(nèi)毒素(LPS)等多種絲裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，進(jìn)一步提示淋巴細(xì)胞可能是黃芩苷免疫調(diào)控的重要靶細(xì)胞。來自腫瘤細(xì)胞的研究表明

3、黃芩苷和黃芩素不僅調(diào)控細(xì)胞的增殖而且具有促凋亡活性，但目前對黃芩苷和黃芩素是否也調(diào)控免疫細(xì)胞的凋亡尚未進(jìn)行充分研究。
　　 免疫細(xì)胞的正常凋亡是機(jī)體建立自身免疫耐受、維持免疫系統(tǒng)自穩(wěn)、以及避免自身免疫應(yīng)答發(fā)展的的重要機(jī)制。而該調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常則與各種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，選擇性的敲除免疫細(xì)胞的促凋亡基因，導(dǎo)致其不能正常凋亡、大量累積，從而可通過慢性淋巴細(xì)胞激活反應(yīng)加速自身免疫反應(yīng)的發(fā)展。在多種自

4、身免疫性疾病動(dòng)物模型或臨床病人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的凋亡機(jī)制發(fā)生異常，即相關(guān)炎癥組織或免疫器官內(nèi)免疫細(xì)胞凋亡減少，使大量的炎性細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞蓄積，導(dǎo)致炎癥持續(xù)反復(fù)的發(fā)作，這可能是自身免疫性疾病患者自身組織炎性損傷和器官功能受損的主要原因之一。許多對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病有明顯的防治作用的免疫抑制劑，包括糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素(cyclosporineA，CsA)、FK506、雷帕霉素(rapamycin，RAPA)1α，25(

5、OH)2D3等，不僅抑制T細(xì)胞的活化增殖，同時(shí)也能誘導(dǎo)激活的T細(xì)胞凋亡來發(fā)揮免疫抑制作用，這是免疫抑制劑治療自身免疫性疾病的重要作用機(jī)制之一。目前對涉及淋巴細(xì)胞死亡的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation-inducedcelldeath，AICD)調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了較深入的研究，普遍認(rèn)為，AICD是機(jī)體清除活化的淋巴細(xì)胞，避免過強(qiáng)免疫應(yīng)答和維持外周免疫耐受的一種重要的負(fù)反饋機(jī)制，因而通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的凋亡機(jī)制促進(jìn)其凋亡是進(jìn)行免疫抑制和

6、防治自身免疫性疾病的有效手段。
　　 基于上述研究進(jìn)展，本項(xiàng)目首先重點(diǎn)探討了黃芩苷和黃芩素在體外細(xì)胞模型上對不同種類和活化狀態(tài)的免疫細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而采用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎小鼠模型，探討了黃芩苷和黃芩素防治自身免疫性疾病的效應(yīng)及其免疫抑制和體內(nèi)誘導(dǎo)T和B淋巴細(xì)胞凋亡的作用。
　　 研究目的:
　　 進(jìn)一步了解黃芩苷和黃芩素的抗炎和免疫調(diào)控作用機(jī)制及其應(yīng)用潛力，為它們的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)

7、。
　　 研究方法:
　　 1、采用ConA和LPS刺激的小鼠脾細(xì)胞、抗CD3/CD28抗體刺激的免疫磁珠純化的CD3+T淋巴細(xì)胞、LPS刺激的免疫磁珠純化的CD19+B淋巴細(xì)胞、小鼠腹腔滲出的巨噬細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞、PMA/離子霉素刺激的JurkatT細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞、bEnd.3小鼠內(nèi)皮細(xì)胞、以及L929小鼠成纖維細(xì)胞等為細(xì)胞模型，分析黃芩苷和黃芩素對不同種類及不同活化狀態(tài)下

8、的免疫細(xì)胞的凋亡的影響。免疫細(xì)胞的凋亡檢測采用熒光標(biāo)記的免疫細(xì)胞特性表面標(biāo)志抗體(CD3、CD19、CD69等)標(biāo)記細(xì)胞后再行annexinV/propidiumiodide(PI)染色，或用抗活化的Caspase3抗體標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀分析不同種類和不同活化狀態(tài)免疫細(xì)胞的凋亡率；通過流式分析細(xì)胞表面Fas和FasL的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位改變，初步分析黃芩苷和黃芩素的促凋亡機(jī)制。
　　 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用膠原Ⅱ(CⅡ)誘導(dǎo)

9、的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠(CIA)為自身免疫性疾病模型，探討黃芩苷的抗炎和免疫抑制效應(yīng)及其體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的作用。DBA/1小鼠于尾根部皮內(nèi)接種乳化的雞Ⅱ型膠原，21天后再用雞Ⅱ型膠原加強(qiáng)免疫，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，于第二次免疫接種后第1天開始每天腹腔注射黃芩苷(50mg/kg體重)，直至第14天。通過小鼠關(guān)節(jié)炎病理評分、關(guān)節(jié)組織病理分析、小鼠后肢計(jì)算機(jī)斷層攝影(Micro-CT)分析等方法檢測黃芩苷對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用，采用ELISA法

10、檢測各實(shí)驗(yàn)組(正常對照、模型組和給藥組)小鼠血清抗體水平以及小鼠脾細(xì)胞體外對CⅡ在刺激誘導(dǎo)的Th1和Th2型細(xì)胞因子的分泌水平分析黃芩苷的免疫抑制作用。采用TUNEL染色和熒光標(biāo)記的抗Caspase3抗體進(jìn)行脾臟的免疫組化分析，以及分離制備脾細(xì)胞懸液后流式分析各類免疫細(xì)胞的凋亡率，分析藥物的體內(nèi)促凋亡作用。
　　 3、采用ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎小鼠模型檢測黃芩素的抗炎和體內(nèi)促凋亡作用。BALB/c小鼠尾靜脈注射ConA(20m

11、g/kg)誘導(dǎo)急性肝損傷，黃芩素(100mg/kg)于ConA注射前2h腹腔注射給藥。ConA注射8h后采集外周血，檢測血清ALT水平，24h取小鼠肝臟和脾臟組織，切片后進(jìn)行H&E染色和免疫熒光化學(xué)分析，檢測肝臟炎癥和損傷程度以及各類免疫細(xì)胞凋亡情況，部分脾臟用以制備脾細(xì)胞懸液，流式分析各類免疫細(xì)胞的凋亡率，分析藥物的體內(nèi)促凋亡作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、黃芩苷和黃芩素在5-40μM劑量范圍內(nèi)能劑量依賴性地抑制C

12、onA(5μg/ml)或LPS(10μg/ml)刺激的小鼠脾細(xì)胞增殖，表明黃芩苷和黃芩素對T和B淋巴細(xì)胞的功能具有顯著的抑制作用。
　　 2、在5-20μM劑量范圍內(nèi)黃芩苷和黃芩素能劑量依賴性地誘導(dǎo)ConA刺激的脾細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步分析脾細(xì)胞中CD3陽性的T細(xì)胞、CD19陽性的B細(xì)胞以及CD11b陽性的巨噬細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷和黃芩素對脾細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞均有有顯著的促凋亡作用，但對CD11b+巨

13、噬細(xì)胞的促凋亡作用極弱。
　　 3、比較了黃芩苷和黃芩素(劑量為10μM，作用時(shí)間為24小時(shí))對不同種類和不同活化狀態(tài)的細(xì)胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩苷對脾細(xì)胞、ConA刺激活化的脾細(xì)胞中的T細(xì)胞、LPS刺激的脾細(xì)胞中的B細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、以及PAM/ionomicin刺激活化的JurkatT細(xì)胞具有較強(qiáng)的促凋亡作用，對胸腺細(xì)胞和骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞僅有較弱的促凋亡作用，而對未活化的JurkatT細(xì)胞、腹腔滲出的巨噬細(xì)胞、RAW264.

14、7巨噬細(xì)胞、bEnd.3小鼠內(nèi)皮細(xì)胞、以及L929小鼠成纖維細(xì)胞的凋亡沒有影響。說明黃芩苷并非無選擇地促進(jìn)所有細(xì)胞的凋亡，而是對B細(xì)胞和T細(xì)胞作用較強(qiáng)。尤其值得注意的是，ConA刺激活化的脾細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞比naive脾細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞對黃芩苷的促凋亡作用更加敏感，PAM/ionomicin刺激活化的JurkatT細(xì)胞比未刺激的JurkatT對黃芩苷的促凋亡作用更加敏感，LPS刺激活化的脾細(xì)胞中的CD19+B細(xì)胞比naive

15、脾細(xì)胞中的CD19+B細(xì)胞對黃芩苷的促凋亡作用更加敏感，這些結(jié)果強(qiáng)烈提示：黃芩苷對活化的T和B細(xì)胞具有選擇性的促凋亡作用。黃芩素的作用與黃芩苷基本類似。上述結(jié)果表明黃芩苷和黃芩素主要是促進(jìn)活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 4、采用免疫磁珠純化的CD3+T細(xì)胞進(jìn)一步分析黃芩素和黃芩苷對T淋巴細(xì)胞的促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)黃芩苷在5-20μM劑量范圍內(nèi)對未活化的CD3+T細(xì)胞幾乎沒有促凋亡作用，但對抗CD3/CD28抗體聯(lián)合刺激活化的C

16、D3+T細(xì)胞則有顯著的促凋亡作用；黃芩素在5-20μM劑量范圍內(nèi)對未活化的和抗CD3/CD28抗體聯(lián)合刺激活化的CD3+T細(xì)胞均有顯著的劑量依賴性的促凋亡作用，但對活化的CD3+T細(xì)胞的促凋亡作用更強(qiáng)。
　　 5、采用免疫磁珠純化的CD19+B細(xì)胞分析黃芩苷和黃芩素對B細(xì)胞的促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)黃芩苷在5-20μM劑量范圍內(nèi)，作用24h，可以劑量依賴性地誘導(dǎo)CD19+B細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且LPS刺激活化的B細(xì)胞比NaiveB細(xì)胞對黃芩

17、苷的促凋亡作用更加敏感；黃芩素促進(jìn)CD19+B細(xì)胞凋亡的作用更強(qiáng)，在5-20μM劑量范圍內(nèi)，黃芩素作用24h即能依賴性地誘導(dǎo)CD19+B細(xì)胞發(fā)生凋亡(黃芩苷作用24h時(shí)對B細(xì)胞凋亡的影響極弱)，而且對LPS刺激活化的B細(xì)胞的促凋亡作用明顯強(qiáng)于NaiveB細(xì)胞。
　　 6、脾細(xì)胞在不同濃度(0-20μM)的黃芩苷和黃芩素存在下培養(yǎng)24h，流式檢測線粒體膜電位的變化以及脾細(xì)胞表達(dá)Fas蛋白及Fas配體的變化(Fas和FasL陽性細(xì)胞

18、百分率)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在5-20μM劑量范圍內(nèi)黃芩苷和黃芩素以劑量依賴的方式誘導(dǎo)脾細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，但在同樣劑量范圍內(nèi)，脾細(xì)胞表面Fas及FasL表達(dá)的百分率未發(fā)生明顯增加，表明黃芩苷和黃芩素主要通過激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性的凋亡途徑促進(jìn)脾細(xì)胞的凋亡，而對死亡受體Fas介導(dǎo)的外源性凋亡途徑無影響。
　　 7、采用CIA小鼠為自身免疫性疾病模型，探討黃芩苷的抗炎和免疫抑制效應(yīng)及其體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)黃芩苷治療組小鼠的

19、關(guān)節(jié)炎病理評分顯著低于模型對照組，關(guān)節(jié)組織病理切片檢查顯示CIA模型小鼠關(guān)節(jié)組織有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，滑膜增殖，關(guān)節(jié)軟骨的破壞和骨質(zhì)侵蝕等癥狀，給予黃芩苷治療后，上述癥狀明顯減輕或消失，說明黃芩苷有顯著的抗關(guān)節(jié)炎效應(yīng)；黃芩苷治療組小鼠脾細(xì)胞在CⅡ體外再刺激下分泌IFN-γ、IL-17和IL-2的能力顯著降低，血清抗CⅡ抗體水平(包括抗體總水平和IgG1、IgG2a亞型抗體水平)亦明顯降低，表明黃芩苷治療后，體內(nèi)的細(xì)胞和體液免疫水平均受到

20、抑制；脾臟冰凍切片免疫熒光分析表明黃芩苷治療組小鼠脾細(xì)胞的凋亡明顯增加，同時(shí)流式分析表明脾細(xì)胞中T和B細(xì)胞的百分率減少，T和B細(xì)胞的凋亡率增加，表明黃芩苷體內(nèi)給藥亦具有促進(jìn)T和B細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：黃芩苷具有體內(nèi)促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡和免疫抑制及抗關(guān)節(jié)炎效應(yīng)。
　　 8、采用ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎小鼠模型檢測黃芩素的抗炎和體內(nèi)促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)黃芩素(100mg/kg)于ConA注射前2h腹腔注射給藥可以降低Con

21、A刺激所致的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，減輕肝組織的損傷和炎性細(xì)胞的浸潤，同時(shí)增加脾臟內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞的凋亡，表明黃芩素具有體內(nèi)促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡和防治免疫性肝炎的作用。
　　 結(jié)論:
　　 黃芩苷和黃芩素體外對活化的T和B細(xì)胞具有選擇性的促凋亡作用，其促凋亡機(jī)制與線粒體相關(guān)的內(nèi)源性凋亡途徑的激活有關(guān)。在CⅡ誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎小鼠模型上，黃芩苷和黃芩素分別顯示抗炎、免疫抑制和促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡的體內(nèi)效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)拓展