HBX蛋白介導的自噬在肝癌多藥耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，且其惡性程度高。化療是肝癌重要的治療手段，但肝癌細胞對化療藥物敏感性差，容易產生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）。在肝癌的發(fā)生機制中，乙肝病毒（HBV）感染是肝癌的發(fā)生的重要因素。整合于宿主細胞的乙型病毒肝炎HBX基因作為重要的功能基因，是影響肝癌生物學特征的重要影響因素。既往有研究表明HBX參與介導了肝癌的多藥耐藥。同時在研究中我們也發(fā)現(xiàn)凋亡并非是肝癌細胞死亡的唯一方式，

2、對凋亡水平的調控也并不能完全干預肝癌細胞的MDR。因此，我們需從非凋亡的角度進一步探索HBX誘發(fā)肝癌細胞耐藥的一些新的可能機制，以期全面地多方面詮釋肝癌發(fā)生MDR的分子機制。自噬（autophagy）作為真核細胞所特有生命現(xiàn)象，已被證明其參與了腫瘤細胞對化療藥物的耐受調控。腫瘤細胞可通過自噬保護性地排除受損蛋白或細胞器，隔離有害物質，加快大分子物質循環(huán)，導致腫瘤細胞表達耐藥表型。機體通過這種特殊的方式來保持內環(huán)境的穩(wěn)定。細胞內存在感知外

3、周環(huán)境變化的信號通路，Gα干擾蛋白（Gα-interacting protein，GAIP）作為重要的自噬調節(jié)上游蛋白，參與了腫瘤細胞的自噬水平改變的調節(jié)。因此，我們需進一步探究HBX蛋白是否介導Gα干擾蛋白的表達而改變了細胞的自噬水平，進而影響了腫瘤細胞多藥耐藥表型的變化。我們將從HBX介導自噬角度去深入地加以研究及探討。
　　第一部分：HBX蛋白轉染后肝癌細胞對化療藥物的抵抗
　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細胞多藥耐藥所

4、產生影響，并對多藥耐藥蛋白表達起到調節(jié)作用。
　　方法：培養(yǎng)及鑒定穩(wěn)定表達HBX蛋白的HepG2人肝癌細胞系及普通HepG2人肝癌細胞系。MTT法觀察 HBX蛋白轉染后肝癌細胞系對化療藥物的抵抗。Western blotting方法檢測多藥耐藥蛋白p170的表達。
　　結果：鑒定及培育了穩(wěn)定表達HBX蛋白的HepG2人肝癌細胞系。穩(wěn)定轉染HBX蛋白的HepG2細胞對鹽酸多柔比星及順鉑化療敏感性低，存在明顯耐藥性，且多藥耐藥蛋

5、白p170（MDR-1表達的跨膜糖蛋白）的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結論：HBX蛋白的穩(wěn)定表達對HepG2細胞的生物學行為產生了影響。穩(wěn)轉HBX蛋白的HepG2細胞對多種化療藥物的敏感性較普通HepG2細胞降低。增強化療藥物外排作用的多藥耐藥蛋白p170的表達上調，提示HBX蛋白參與調控了該蛋白表達，實驗組細胞出現(xiàn)耐藥性增強的現(xiàn)象。
　　第二部分：HBX蛋白對肝癌細胞自噬水平的調節(jié)作用

6、>　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細胞自噬水平的調節(jié)作用。
　　方法：Western blotting方法檢測HBX蛋白對自噬蛋白Becline1、LC3-Ⅱ表達的調節(jié)作用。
　　結果：穩(wěn)定轉染HBX蛋白的HepG2細胞較對照組肝癌細胞內自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表達升高，差異有顯著性（P<0.01），提示HBX蛋白上調了HepG2細胞的自噬水平。
　　結論：HBX蛋白對肝癌細胞的自噬水平產生了調節(jié)作用。穩(wěn)定轉染

7、HBX蛋白的HepG2細胞較普通HepG2細胞的自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表達量均增高，表明其自噬水平上調。
　　第三部分：改變自噬水平影響肝癌細胞對化療藥物的敏感性
　　目的：改變肝癌細胞的自噬水平后觀察細胞對化療藥物敏感性變化及其對多藥耐藥蛋白p170表達的影響。
　　方法：上調自噬水平的雷帕霉素及下調自噬水平的3-MA、溶酶體抑制劑 E64作用于二組肝癌細胞系后，Western blotting方法及M

8、TT法檢測不同自噬水平對肝癌細胞化療敏感性的影響。
　　結果：自噬水平的上調使HepG2細胞對化療藥物的敏感性下降，多藥耐藥蛋白p170表達上調（P<0.05），耐藥性增強；而E-64、3-MA對肝癌細胞自噬水平的抑制提高了HepG2細胞的化療敏感性，多藥耐藥蛋白p170表達下調（P<0.01），耐藥性降低。
　　結論：自噬水平改變調節(jié)了肝癌細胞的化療敏感性，證明了 HBX蛋白介導自噬參與了多藥耐藥。
　　第四部分：G

9、AIP在HBX蛋白誘導肝癌細胞自噬中的作用
　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細胞自噬上游Gα干擾蛋白的調節(jié)作用。
　　方法：熒光定量PCR方法、Western blotting方法檢測GAIP在HBX蛋白誘導肝癌細胞自噬中的表達情況。
　　結果：在穩(wěn)定轉染HBX蛋白的HepG2細胞中，自噬調節(jié)蛋白GAIP在mRNA和蛋白水平表達均顯著增高，提示HBX蛋白可上調自噬調節(jié)蛋白GAIP的表達，較對照組差異性顯著（P<0.01）