乙型腦炎病毒及黃熱病病毒寡核苷酸檢測芯片初步研究.pdf

1、乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)引起，經(jīng)蚊蟲叮咬傳播的一種傳染性疾病。該病能引起嚴(yán)重的腦炎，往往會導(dǎo)致永久性的大腦損傷，且死亡率高。全球大概每年有35，000-50，000例乙型腦炎患者，該病主要分布于亞洲地區(qū)。 黃熱病由黃熱病病毒(YFV)引起，曾在南美洲、非洲等熱帶地區(qū)引起大范圍的流行，每年估計有200，000例黃熱病患者(30，0001例死亡)。 JEV與YFV同屬于黃病毒屬，病程早期對疾病診斷都有一定困難。由于

2、目前尚無有效手段阻止或延緩病程發(fā)展，因此早期實驗室檢測(JEV/YFV)對于迅速做出診斷，確立正確的治療方案、避免誤診、貽誤病程有重要意義。 傳統(tǒng)的實驗室診斷方法往往依賴于免疫學(xué)方法檢測病毒抗原。由于JEV、YFV與其它黃病毒之間會產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，所以傳統(tǒng)的診斷方法容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。基于RT-PCR技術(shù)的分析方法也被應(yīng)用于檢測JEV、YFV，但也無法避免假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。 基因芯片技術(shù)代表著分子技術(shù)領(lǐng)域的最

3、新發(fā)展，具有快速診斷和敏感的核酸分析能力。該技術(shù)在微生物分析、病原體檢測、基礎(chǔ)和應(yīng)用環(huán)境科學(xué)的監(jiān)控等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究首先運用生物信息學(xué)軟件如BLAST，0ligo6.0，DNAClub，篩選出特異性高，長度一致，Tm值相近的寡核苷酸探針，經(jīng)BLAST比對排除非特異性探針。分別針對JEV及YFV設(shè)計并合成了17和19條寡核苷酸探針，各自用于點樣制備寡核苷酸檢測芯片。 采用正常人血清總RNA、登革熱病毒質(zhì)粒

4、、丙型肝炎病毒質(zhì)粒作為陰性對照樣品。克隆有JEV、YFV基因的質(zhì)粒樣品用于驗證探針。通過采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進行全基因組擴增標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物純化后與芯片進行雜交。采用激光共聚焦掃描儀進行掃描，GenePix6.0軟件采集圖像并進行圖像分析，對探針進一步篩選。 探針初步篩選后，應(yīng)用于制備JEV，YFV聯(lián)合診斷芯片。限制性熒光標(biāo)記樣品倍比稀釋后與Oligo芯片雜交，分析芯片檢測的靈敏度。 以A/T克隆分別將NS1、NS2a、

5、NS2b、NS4a和NS4b基因片段與pMD18-T載體連接，應(yīng)用常規(guī)PCR和不對稱PCR兩種方法進行摻入熒光標(biāo)記，將熒光標(biāo)記樣品與寡核苷酸芯片雜交，在相同條件下完成雜交清洗和芯片的掃描檢測。發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不對稱PCR技術(shù)對樣品進行熒光標(biāo)記后，與寡核苷酸芯片雜交能提高芯片的雜交效率。同時實驗中發(fā)現(xiàn)探針不同的雜交效率可能與其距靶片段3’端位置的距離有關(guān)。 本課題通過實驗室研究，得到以下實驗結(jié)果：(1)比較在不同退火溫度下限制性顯示擴增的

6、情況，結(jié)果表明選用退火溫度為55℃30s，58℃30s，60℃30s時，擴增效率較佳。 (2)運用倍比稀釋的方法分析60mer寡核苷酸芯片檢測的靈敏度，結(jié)果可得芯片檢測的靈敏度不低于0.04ng/μl(0.15nmol/l)。 (3)經(jīng)過初步的雜交分析，排除部分非特異性探針后，將篩選出的28條寡核苷酸探針用于制備JEV和YFV聯(lián)合診斷芯片。 (4)發(fā)現(xiàn)探針位于靶片段遠3’端位置時，其雜交信號顯著低于近3’端位置的