何首烏二苯乙烯苷對(duì)缺血性腦損傷和學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：二苯乙烯苷對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　 目的：缺血性腦損傷因其高致殘率和致死率被認(rèn)為是威脅人類生命健康最主要的原因之一。研究表明，缺血再灌注過(guò)程中活性氧/氮族（reactive oxygen/nitrogen species，ROS/RNS）的過(guò)度產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激可以通過(guò)破環(huán)細(xì)胞膜正常功能，引起胞內(nèi)鈣離子超載，激活胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)的

2、信號(hào)通路如c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-teminal Kinase，JNK），引起線粒體功能紊亂等，導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子的釋放和表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡壞死。缺血再灌注損傷過(guò)程中產(chǎn)生的ROS還能活化重要的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），增強(qiáng)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)，從而使氮自由基如一氧化

3、氮（nitrogen oxide，NO）、亞硝酸鹽的產(chǎn)生進(jìn)一步增多。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside，TSG），是從中藥何首烏中提取的一種具有多酚結(jié)構(gòu)的活性成分，已證實(shí)其具有清除自由基、抗氧化、抗炎的作用。但TSG是否對(duì)腦缺血損傷有保護(hù)作用，目前尚未見報(bào)道。本研究旨在從細(xì)胞和整體水平考察TSG對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：建立原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元氧-糖剝奪（oxy

4、gen-glucose deprivation，OGD）模型，采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）比色法和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞活性；Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位（mit

5、ochondrial membrane potential，MMP）變化和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活程度；鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子水平；免疫印跡（western blotting）和實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2，Bax）、應(yīng)激活化蛋白JNK、抗衰老蛋白沉默信息調(diào)節(jié)因子類型1（silent iNFormation regulator type 1，SIRT1）及iNOS表達(dá)水平。采用大腦

6、中動(dòng)脈栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立小鼠局灶性腦缺血損傷再灌注模型，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法測(cè)定腦梗死面積和體積，Tunel法檢測(cè)皮層組織神經(jīng)元凋亡程度。
　　 結(jié)果：細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)1 h，2 h，4 h OGD再灌注24 h后，與對(duì)照組相比，MTT法顯示細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性降低。

7、因此我們選擇OGD 2 h再灌注24 h（oxygen-glucose deprivation following reperfusion，OGD-R）作為后續(xù)的離體細(xì)胞缺血再灌注損傷模型。與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)OGD-R處理后，細(xì)胞存活率降低，LDH釋放增加；Hoechst染色表明凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞核呈固縮突亮或碎塊狀致密濃染。經(jīng)過(guò)不同濃度的TSG（5 μM，10 μM，25 μM，50 μM，100 μM）預(yù)處理細(xì)胞后能減輕OGD-R

8、所致的細(xì)胞損傷，減少胞內(nèi)ROS積聚，逆轉(zhuǎn)MMP的驅(qū)散；減輕H2O2所致的胞內(nèi)鈣超載。Western blotting和Real-time PCR結(jié)果顯示，TSG能減少OGD-R處理后促凋亡蛋白Bax及應(yīng)激活化蛋白p-JNK的水平，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。TSG孵育細(xì)胞可增強(qiáng)SIRT1蛋白表達(dá)，能減弱OGD-R所致的NF-κB活化，減少OGD-R所致的iNOS基因的表達(dá)。SIRT1抑制劑煙酰胺（nicotinamide）削弱了TS

9、G對(duì)NF-κB激活和iNOS表達(dá)增加的抑制作用。TTC染色法顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死面積和體積增加，TSG組腦梗死面積和體積均減少。Tunnel法顯示，TSG組皮層組織神經(jīng)元凋亡程度減輕。
　　 結(jié)論：二苯乙烯苷可通過(guò)清除自由基，減輕鈣超載，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)和應(yīng)激活化蛋白JNK的磷酸化水平，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，激活抗衰老蛋白SIRT1和抑制NF-κB激活等途徑發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　

10、　 第二部分：二苯乙烯苷對(duì)小鼠海馬突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制
　　 目的：隨著人口老齡化問(wèn)題逐漸加重，衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、血管性癡呆（vascular dementia，VD）及帕金森病（Parkinson's disease，PD）等伴隨的認(rèn)知功能損傷和學(xué)習(xí)記憶能力的下降，成為影響人民生活質(zhì)量的重大問(wèn)題。何首烏是我國(guó)一種沿用已久的用于抗衰老治療的名貴

11、中藥。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucosid，TSG）是從何首烏中提取的一種具有多酚結(jié)構(gòu)的活性成分。最近的研究表明，TSG對(duì)衰老大鼠和APP轉(zhuǎn)基因的AD模型鼠海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)和學(xué)習(xí)記憶能力均有所改善。但TSG是否對(duì)正常動(dòng)物的突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶能力有調(diào)節(jié)作用，其具體的分子機(jī)理是什么，目前尚未見報(bào)道。本研究旨在從腦片水平觀察TSG對(duì)正常小鼠海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiatio

12、n，LTP）的調(diào)節(jié)及對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　 方法：急性分離小鼠海馬腦片，采用細(xì)胞外場(chǎng)電位記錄和western blotting的方法研究TSG對(duì)海馬CA1區(qū)LTP的影響及其機(jī)制。采用行為學(xué)方法觀察灌胃給予TSG對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所用濃度的TSG（0.1 μM，1 μM，5 μM，10 μM）對(duì)海馬CA1區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）

13、受體依賴的LTP的增強(qiáng)作用呈鐘形分布，且在1 μM時(shí)作用最明顯，但對(duì)基礎(chǔ)突觸傳遞和反映突觸前反應(yīng)的雙波易化（paired pulse facilitation，PPF）和輸入-輸出反應(yīng)（input-output curve，I/O curve）均無(wú)影響。TSG增強(qiáng)LTP的作用需要鈣/鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extrace

14、llular signal-regulated kinases，ERKs）的激活。行為學(xué)結(jié)果顯示，TSG處理的小鼠在Morris水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照組。透射電鏡的結(jié)果顯示，TSG增加小鼠海馬CA1區(qū)輻射層的突觸后致密物（postsynaptic density，PSD）面積。
　　 結(jié)論：TSG增強(qiáng)正常小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體依賴的LTP和學(xué)習(xí)記憶能力，這些增強(qiáng)作用可能與其激活學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的關(guān)鍵分子CaMKⅡ和ER