一氧化氮對(duì)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元L型鈣通道的調(diào)控及其機(jī)制.pdf

1、一氧化氮(NO)是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與腦內(nèi)許多生理和生理病理過(guò)程。大量證據(jù)表明伴隨著缺氧和缺血的腦損傷，海馬神經(jīng)元會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的NO。缺氧缺血時(shí)，離子跨膜重新分布，增加的鈣內(nèi)流能明顯地影響NO合成酶的活性和產(chǎn)生NO的量，從而改變神經(jīng)組織中的NO水平。然而，目前仍不清楚內(nèi)源性的NO與引起鈣內(nèi)流的離子通道之間的關(guān)系。另外，對(duì)NO通過(guò)何種機(jī)制來(lái)介導(dǎo)鈣內(nèi)流也不十分清楚。L型鈣通道在海馬錐體神經(jīng)元上分布很廣，約30-50％的鈣離子總電流來(lái)自

2、L型鈣通道。因此，調(diào)控L型鈣通道的活動(dòng)將顯著影響鈣離子的內(nèi)流。 該研究探討了內(nèi)源性一氧化氮對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元L型鈣通道的作用及其機(jī)制。當(dāng)從鉗制電位-50mV去極化至0mV時(shí)，NOS的底物L(fēng)-精氨酸(L-Arg，1-3mM)增加了61％的L鈣電流(n=30，p＜0.01)。另外，L-Arg使從-20mV到10mV的電流電壓曲線(I-V)左移，說(shuō)明這時(shí)的通道對(duì)去極化的電壓變得更敏感。尼菲地平(NFDP)是二氫吡啶類(lèi)的L型鈣通道的阻斷劑

3、。20uMNFDP將L鈣電流減少了60％(n=3，p＜0.05)，L-Arg不再使剩余的電流增大，說(shuō)明L-Arg的作用是通過(guò)L型鈣通道起作用的。與L-Arg的作用相反，NOS的抑制劑NG-Nitro-L-ArginineMethylEster(L-NAME，1-3mM)明顯減少約51％的L鈣電流(n=8，p＜0.01)，提示在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上一氧化氮(NO)對(duì)通道有基礎(chǔ)調(diào)節(jié)。若預(yù)處理1mML-NAME(n=16)和另一種nNOS抑制劑

4、7-Nitroindazole(7-NINA，n=10)，兩者皆能部分阻斷L-Arg對(duì)通道電流的增大作用(p＜0.05)。這些結(jié)果表明內(nèi)源性的NO能使海馬L型鈣通道增強(qiáng)通道開(kāi)放和提高其對(duì)電壓的敏感性。 為了探測(cè)S-亞硝化是否參與介導(dǎo)內(nèi)源性NO引起的通道活動(dòng)，該文用N-ethylmaleimide(NEM，能二價(jià)修飾蛋白硫醇基團(tuán)從而阻止進(jìn)一步的S-亞硝化反應(yīng))和維生素C(VitC，能還原地打開(kāi)亞硝基硫醇(nitrosotiol)而

5、非二硫鍵)來(lái)看它們是否能影響L-Arg對(duì)L型鈣通道的調(diào)控。1mMNEM預(yù)處理完全阻斷L-Arg的增大作用，而且，NEM的存在使L-Arg反而產(chǎn)生抑制的作用(n=14，p＜0.01)，提示除了S-亞硝化通路外，另一種抑制的機(jī)制例如cGMP通路可能也參與通道的調(diào)控。單獨(dú)給予VitC(0.5mM)能使20mV到60mV的電流電壓曲線(I-V)右移，這與L-Arg的作用正好相反。并且，當(dāng)L-Arg引起I-V左移后，2mM的VitC幾乎逆轉(zhuǎn)了這一

6、效應(yīng)。以上的結(jié)果表明S-亞硝化參與內(nèi)源性NO對(duì)L型鈣通道的調(diào)控。為了探查cGMP途徑是否參與，該文用可溶的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的阻斷劑1H-[1，2,4]Oxadiazolo[4，3-a]quinoxalin-1-one(ODQ，10uM)對(duì)神經(jīng)元作預(yù)處理，這種處理對(duì)L-Arg引起的通道活動(dòng)的增大作用無(wú)明顯的影響(n=8，p＞0.05)，然而，它能降低L-Arg增強(qiáng)通道所需的劑量。用ODQ預(yù)處理后，1mM的L-Arg在所有被檢測(cè)細(xì)胞上均能增大L

7、鈣電流(8/8)，而不作處理的細(xì)胞中，僅有57％的細(xì)胞(17/30)能用1mM的L-Arg來(lái)增大電流，其余53％的細(xì)胞需增大劑量至3mM才有效。另外，8-Br-cGMP(cGMP的衍生物，能模擬cGMP被激活時(shí)產(chǎn)生的效應(yīng))可抑制L鈣電流。當(dāng)從鉗制電位-50mV去極化至0mV時(shí)，0.5mM8-Br-cGMP可抑制11％的電流(n=9，p＜0.05)。這些結(jié)果顯示cGMP通路也可參與內(nèi)源性NO對(duì)L型鈣通道的調(diào)控，但這種調(diào)控較弱而且是下調(diào)的，

8、與S-亞硝化作用相反。 該文用NO供體進(jìn)一步探討了NO對(duì)L鈣電流的作用及其機(jī)制。NO供體0.5mMDETA可增大L鈣電流，其增大主要在I-V曲線的-20mV到10mV之間使電流增大，與L-Arg一致。當(dāng)電壓去極化至0mV時(shí)，0.5mMDETA使電流增大約23％(n=11，p＜0.01)。DETA的增強(qiáng)機(jī)制也與L-Arg一致。該文發(fā)現(xiàn)用1mMNEM預(yù)處理細(xì)胞以阻斷S-亞硝化反應(yīng)時(shí)，0.5mMDETA對(duì)通道不再有增大作用(n=8)，

9、表明DETA通過(guò)S-亞硝化機(jī)制來(lái)使L鈣電流增大。當(dāng)用可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑10uMODQ預(yù)處理細(xì)胞后，0.5mMDETA不但使通道增強(qiáng)，而且電流增大的幅度比無(wú)預(yù)處理組大(n=6，p＜0.01)，表明cGMP途徑對(duì)通道起抑制性作用，與S-亞硝化的作用相反。以上結(jié)果進(jìn)一步支持，S-亞硝化機(jī)制與cGMP途徑均參與NO對(duì)通道的調(diào)控作用，S-亞硝化對(duì)通道的增強(qiáng)作用較強(qiáng)，而cGMP途徑對(duì)通道的抑制作用較弱。 另二類(lèi)NO供體對(duì)海馬L型鈣通道

10、則主要呈現(xiàn)為抑制作用。3mMDEA主要效應(yīng)為抑制L型鈣通道，當(dāng)電壓去極化至10mV時(shí)，電流被抑制了29％(n=5，p＜0.01)。NO供體SNP也主要對(duì)通道起抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性：3例0.1mMSNP均對(duì)電流無(wú)明顯影響；12例0.2-0.6mMSNP實(shí)驗(yàn)中，5例有抑制作用，當(dāng)電壓去極化至10mV時(shí)，電流被抑制了16％(n=5，p＜0.01)，另7例則對(duì)電流無(wú)明顯的影響；當(dāng)SNP為1mM時(shí)，所記錄的11例細(xì)胞中有6例細(xì)胞呈抑制作用

11、，去極化至10mV時(shí)其抑制值為16％。(n=6，p＜0.01)，另有3例細(xì)胞呈增強(qiáng)效應(yīng)，2例細(xì)胞無(wú)明顯影響；在34例3-9mMSNP的實(shí)驗(yàn)中，27例起抑制作用，其中3mM抑制了20％的電流(去極化至10mV，下同，n=11，p＜0.01)；6mM抑制了33％的電流(n=10，p＜0.01)；9mM抑制了31％的電流(n=8，p＜0.01)，除了抑制作用外，另7例為增大效應(yīng)的。該文利用3-9mMSNP來(lái)探討其機(jī)制。當(dāng)用1mMNEM預(yù)處理以

12、阻斷S-亞硝化通路后，3mMSNP對(duì)L鈣電流產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)電壓去極化至10mV時(shí)，電流被抑制了28％(n=8，p＜0.01)，雖然與不作預(yù)處理組(20％)比有進(jìn)一步抑制的趨勢(shì)，但并不顯著(p＞0.05)，表明S-亞硝化機(jī)制在3mMSNP對(duì)L型鈣通道的調(diào)控中不起主導(dǎo)作用。另外，以10uMODQ預(yù)處理細(xì)胞以阻斷cGMP這一抑制性途徑后，4mMSNP仍能對(duì)通道起抑制作用，表明存在另一種抑制性機(jī)制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，SNP的作用可被還原

13、劑DTT逆轉(zhuǎn)，當(dāng)3mMSNP產(chǎn)生抑制作用并使I-V曲線左移時(shí)，2mMDTT后處理可使I-V曲線右移并使電流增大，因而這另一種抑制性機(jī)制可能為氧化機(jī)制。并且，該文發(fā)現(xiàn)氧化劑DTNB對(duì)L型鈣通道有抑制作用，而其抑制效應(yīng)呈劑量依賴(lài)性：當(dāng)電壓去極化至10mV時(shí)，0.5mMDTNB使電流抑制了10％(n=3，p＜0.05)；1mMDTNB使電流抑制了14％(n=5，p＜0.01)；3mMDTNB使電流抑制了35％(n=5，p＜0.01)；5mMD