外源性一氧化氮對大鼠慢性胃潰瘍的保護作用及其機制.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 外源性一氧化氮對大鼠慢性胃潰瘍的保護作用
　　目的:
　　迷走神經(jīng)在胃腸道炎癥發(fā)生時通過膽堿能抗炎癥反射（Cholinergic anti-inflammation reflex，CAIF），又稱炎癥反射(Inflammation Reflex)調(diào)節(jié)和控制免疫反應，抑制炎癥水平，但在胃腸道發(fā)生炎癥時局部迷走神經(jīng)末梢被激活的傳入通路尚不清楚。多項研究表明NO在胃潰瘍的發(fā)生中發(fā)

2、揮保護作用，但機制尚不明確。有研究提示一氧化氮能夠間接激活消化道迷走神經(jīng)末梢，然而尚沒有直接證據(jù)表明其參與膽堿能抗炎反射。本研究的目的是證實外源性一氧化氮對胃潰瘍的保護作用是直接激活迷走神經(jīng)，同時探索其可能的機制。
　　方法:
　　通過胃壁漿膜下注射冰醋酸的方法誘導大鼠慢性胃潰瘍模型。通過腹膜腔注射NO外源性供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP），或者預先膈下迷走神經(jīng)切除術后腹膜腔注射SNP，或者聯(lián)合

3、注射SNP及TRPV1通道阻斷劑(capsazepine，CZP)干預潰瘍的形成。術后第四天處死動物通過測量潰瘍面積、組織切片HE染色、組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測等方法評估炎癥水平。
　　結果:
　　1.SNP對潰瘍面積、宏觀形態(tài)的影響
　　腹膜腔注射SNP對胃黏膜組織的充血、水腫及潰瘍形成有明顯改善作用，潰瘍面積明顯減小，由1.16±0.12mm2減小到0.74±0.12mm2

4、(P＜0.05，n=6)，同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后，SNP的作用消失。
　　2.SNP對胃組織組織學表現(xiàn)的影響
　　冰醋酸對照組可見胃黏膜下層結構破壞，出血及滲出，炎性細胞浸潤。腹膜腔注射SNP后炎癥表現(xiàn)明顯減輕，同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后，SNP的作用消失。
　　3.SNP對胃組織內(nèi)MPO活性的影響
　　冰醋酸對照組大鼠胃組織的MPO活性比生理鹽水對照組明顯增高(1.79±0.37U/

5、g vs0.23±0.05U/g，P＜0.05，n=6)。經(jīng)SNP連續(xù)腹膜腔注射4天后，胃的MPO活性顯著降低(P＜0.05，n=6)。同時注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術后，SNP的作用消失。
　　結論:
　　外源性NO對冰醋酸誘導的大鼠慢性胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展起到保護作用，這種作用是通過迷走神經(jīng)實現(xiàn)的，提示NO可能參與迷走神經(jīng)抗炎反射的傳入通路，并且TRPV1通道可能參與這個過程。
　　第二部分 外源性一氧化氮對大鼠腸

6、系膜傳入神經(jīng)放電的影響及其機制
　　目的:
　　本研究的目的是探索外源性一氧化氮對腸系膜傳入神經(jīng)放電的直接作用及其機制，以期揭示NO在傳入神經(jīng)水平的抗炎作用機制。
　　方法:
　　利用離體腸系膜傳入神經(jīng)電活動記錄分析技術記錄SNP對離體雄性大鼠、小鼠和TRPV1-/-小鼠空腸傳入神經(jīng)生物電活動的影響，并用單信號分析(Single Unit Analysis)方法分析其對不同類型神經(jīng)纖維的作用。并分別用膈下迷走神經(jīng)

7、切斷術、巰基保護劑N-ethylmaleimide(NEM)、選擇性GC阻斷劑1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one(ODQ)、TRPV1阻斷劑CZP研究SNP的作用機制。
　　結果:
　　1.NO供體SNP對大鼠腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的影響
　　待神經(jīng)放電穩(wěn)定后，向腸段漿膜面加入4mM的SNP，2min內(nèi)腸系膜傳入神經(jīng)放電頻率明顯增加，放電頻率差值從1.3±1.2imp

8、/s增加到48.5±7.3imp/s(P＜0.05，n=6)，而低濃度(0.01mM)的SNP對自發(fā)放電并沒有顯著作用(P＞0.05，2=6)，SNP的作用表現(xiàn)出濃度依賴性，半數(shù)有效率ED50為0.16mM。
　　2.NO供體SNP對傳入神經(jīng)中不同神經(jīng)成分的自發(fā)放電的影響
　　用單信號分析(single-unit analysis)的方法，分析到59個機械敏感性傳入神經(jīng)放電信號。其中17個信號發(fā)自低閾值神經(jīng)纖維，一般認為這類

9、纖維為迷走傳入纖維;20個信號發(fā)自高閾值神經(jīng)纖維，一般認為這類纖維為脊神經(jīng)中的內(nèi)臟痛覺傳入纖維;其余22個信號發(fā)自寬閾值神經(jīng)纖維。SNP增加了低閾值神經(jīng)纖維的自發(fā)放電水平(P＜0.05)，但對高閾值的纖維成分沒有影響。
　　3.膈下迷走神經(jīng)切斷術對SNP作用的影響
　　大鼠在麻醉狀態(tài)下行膈下迷走神經(jīng)切斷術，14天后犧牲動物，取出空腸，用含0.16mM SNP的柯氏液預孵育后，迷走神經(jīng)切斷手術組的大鼠傳入神經(jīng)放電頻率增加值降低

10、到2.6±0.4imp/s，明顯低于假手術組(26.9±5.2imp/s，P＜0.01，n=6)。
　　4.巰基保護劑及選擇性GC阻斷劑對SNP作用的影響
　　在器官浴槽中加入NEM(5mM)預孵育15min后，SNP不再引起腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的增加，NEM組加入SNP后放電頻率增加值比DMSO組明顯降低，從23.4±5.2imp/s降至0.2±5.7imp/s（P＜0.05，n=6）;然而ODQ(10μM)預孵育10m

11、in并不影響SNP的作用（P=0.52，n=6）。
　　5.TRPV1通道阻斷劑、基因敲除對SNP作用的影響及SNP對辣椒素敏感性的影響
　　空腸標本用含CZP(50μM)的柯氏液預孵育10min后，SNP誘發(fā)放電增加較DMSO對照組明顯降低，從25.8±5.6imp/s降至8.4±4.1imp/s(P＜0.05，n=6)。SNP和辣椒素具有明顯的協(xié)同作用，兩者共同作用所引起的傳入神經(jīng)放電頻率增加值從8.2±1.8imp/s

12、（辣椒素的單獨作用）增加至20.9±2.7imp/s(P＜0.05，n=6)。SNP對TRPV1基因敲除小鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的作用遠低于野性型小鼠（P＜0.001，n=6）。
　　結論:
　　SNP通過激活大鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)中的迷走神經(jīng)纖維末梢，上調(diào)其自發(fā)放電的頻率，該作用主要是通過巰基亞硝基化作用實現(xiàn)的，TRPV1通道參與了這一過程。
　　第三部分 外源性一氧化氮對大鼠結狀神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電活動的影響及

13、其機制
　　目的:
　　前期實驗證實SNP通過巰基亞硝基化作用激活腸系膜迷走神經(jīng)傳入纖維，且在這個過程中有TRPV1通道的參與。為了進一步證實SNP對迷走神經(jīng)的選擇性激活作用，并驗證TRPV1是巰基亞硝基化的靶點，在神經(jīng)元水平進行電生理實驗，進一步研究SNP的作用及其機制。
　　方法:
　　分離大鼠結狀神經(jīng)節(jié)（nodose ganglion，NG）、T7-L5節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gangli

14、on，DRG)，消化分離出單個神經(jīng)元細胞后接種于玻片上。利用全細胞膜片鉗記錄神經(jīng)元細胞靜息膜電位、辣椒素(capsaicin，CAP)激發(fā)膜電流，電信號通過Axon膜片鉗放大器和A/D轉(zhuǎn)換器記錄入計算機，使用Clampex10.2軟件進行信號采集和分析。
　　結果:
　　1.NO供體SNP對NG神經(jīng)元細胞靜息膜電位的影響
　　NG細胞的靜息膜電位為-57.4±1.3mV(n=43)。SNP(0.16mM)使NG細胞膜發(fā)

15、生明顯去級化(P＜0.05，n=7)，經(jīng)細胞外液沖洗可部分恢復，低濃度的SNP(0.016mM)不影響NG神經(jīng)元的膜電位。
　　2.巰基保護劑及選擇性GC阻斷劑對SNP作用的影響
　　用含巰基保護劑NEM(5mM)的細胞外液孵育NG細胞15min后，SNP引起膜去極化的作用明顯減低（P＜0.01，n-7）。然而選擇性GC阻斷劑ODQ(10μM)預孵育10min并不影響SNP的作用。
　　3.TRPV1通道阻斷劑對SNP

16、作用的影響
　　用TRPV1阻斷劑CZP(50μM)孵育NG細胞10min后，SNP引起膜去極化的作用明顯減低(P＜0.05，n=7)。
　　4.SNP對NG神經(jīng)元細胞辣椒素電流的影響
　　SNP(0.16mM)顯著增加NG細胞中辣椒素誘發(fā)的內(nèi)向電流(capsaicin-induced inward current，Icap)的幅度，電流峰值從-609.4±88.0pA增加至-1224.3±202.1pA（P＜0.05

17、，n=7）。NEM(5mM)孵育顯著降低SNP的作用，而ODQ(10μM)對其沒有明顯影響。
　　5.SNP對DRG神經(jīng)元細胞靜息膜電位的影響
　　SNP（0.0016-0.16mM）使DRG細胞膜電位發(fā)生超級化(P＜0.05，n=7)，經(jīng)細胞外液沖洗可恢復至靜息膜電位水平，呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結論:
　　SNP能夠通過巰基亞硝基化作用激活NG神經(jīng)元上的TRPV1通道，并提高神經(jīng)元細胞對辣椒素的化學敏感性，提示