人子宮內(nèi)膜窗口期基因表達(dá)平臺(tái)的建立及特異基因的篩選.pdf

1、胚胎著床是哺乳動(dòng)物獨(dú)有的涉及胚胎和母體子宮內(nèi)膜相互作用的生殖過程。此過程在時(shí)間和空間上都是高度有序的。哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜只有在著床窗開放時(shí)，才能接受胚泡，最終完成著床。人類的子宮內(nèi)膜僅在月經(jīng)周期很短的一段時(shí)期可以接受胚胎著床。大量研究證實(shí)這一時(shí)期主要受激素調(diào)控，接受態(tài)子宮內(nèi)膜的形成是這一時(shí)期的一個(gè)重要事件。為了解著床窗口期事件包括接受態(tài)子宮內(nèi)膜形成及胚胎著床等過程中的分子機(jī)制的全貌并深入研究著床窗口期的分子調(diào)控機(jī)制，本研究采用抑制消減雜

2、交技術(shù)，將人著床窗口期和早泌期子宮內(nèi)膜組織cDNA互相消減，構(gòu)建了這兩個(gè)時(shí)期的雙向消減cDNA文庫，并對(duì)篩選出來的部分已知和未知基因進(jìn)行了深入探索。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.為了構(gòu)建人子宮內(nèi)膜窗口期基因表達(dá)平臺(tái)，我們從最初的實(shí)驗(yàn)材料選擇就嚴(yán)格把關(guān)。我們以同一位志愿者的不同時(shí)相的子宮內(nèi)膜作為自身對(duì)照，結(jié)合掃描電鏡觀察結(jié)果、B超檢測(cè)結(jié)果、HE染色結(jié)果和PR免疫組化染色結(jié)果從多方面驗(yàn)證了材料的可靠性，為后續(xù)的分子生物學(xué)

3、實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 2.SMARTM PCR cDNA Synthesis技術(shù)和抑制性消減雜交技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建了人窗口期子宮內(nèi)膜和早泌期子宮內(nèi)膜雙向cDNA抑制消減文庫。
　　 3.在人窗口期子宮內(nèi)膜cDNA文庫(HWE)和人早泌期子宮內(nèi)膜cDNA文庫(HEW)911個(gè)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交分析，有354個(gè)在人窗口期和早泌期子宮內(nèi)膜存在4倍以上表達(dá)差異，其中192個(gè)在窗口期差異表達(dá)，162個(gè)在早泌期差異表達(dá)

4、。對(duì)斑點(diǎn)雜交篩選出的354個(gè)克隆中的130個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，共產(chǎn)生了93個(gè)質(zhì)量滿意的ESTs，總測(cè)序成功率達(dá)到71.54％。
　　 4.通過在互聯(lián)網(wǎng)上的比對(duì)，在HWE文庫中已知基因、已知ESTs和全新ESTs分別為52.46％、40.98％和6.56％；在HEW文庫中分別為48.57％、48.57％和2.86％。
　　 5.對(duì)代表已知基因的ESTs按照功能分類，發(fā)現(xiàn)主要涉及細(xì)胞分裂/細(xì)胞凋亡、蛋白合成和分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、分子

5、伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、粘附分子幾類，并初步探討了人子宮內(nèi)膜圍著床過程中差異表達(dá)基因的作用和意義。
　　 6.通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在HWE文庫中編號(hào)為82G7的克隆序列與已知基因NID-1同源性很高，用原位雜交技術(shù)檢測(cè)在窗口期和早泌期人子宮內(nèi)膜的表達(dá)，結(jié)果顯示NID-1在窗口期子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，在早泌期的子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)很弱。根據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)，NID-1基因的表達(dá)產(chǎn)物的作用可能在人類的胚胎發(fā)生、著床和蛻膜化反

6、應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　 7.將人子宮內(nèi)膜窗口期特異表達(dá)的克隆編號(hào)為82F4的EST序列進(jìn)行RACE擴(kuò)增獲得一個(gè)新的cDNA序列，命名為PPI-82-F4，登錄GenBank，獲得登錄號(hào)為EF063108。
　　 8.應(yīng)用Northern雜交技術(shù)檢測(cè)PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宮內(nèi)膜的表達(dá)，結(jié)果顯示PPI-82-F4在窗口期子宮內(nèi)膜的表達(dá)顯著高于早泌期。應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子

7、宮內(nèi)膜的表達(dá)，結(jié)果顯示PPI-82-F4在窗口期子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在早泌期的子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)很弱。
　　 綜上所述，我們采用抑制性消減雜交構(gòu)建了雙向人子宮內(nèi)膜窗口期消減早泌期cDNA文庫，在這兩個(gè)文庫中各有192和162個(gè)陽性差異的克隆，我們所得到的基因包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架幾類。母體子宮內(nèi)膜從排卵到著床的過程中發(fā)生劇烈的變化，在孕激素的調(diào)控下，為了使著床窗開放做了充分準(zhǔn)備，有很多相關(guān)基因表