CABG移植血管痙攣因素分析及預防的實驗研究.pdf

1、冠脈搭橋手術(shù)(CABG)距今已經(jīng)有 60 年的歷史。目前已經(jīng)成為心臟外科最為常見的手術(shù)之一。雖然目前靜脈橋仍在廣泛應用中，但實踐證明靜脈血管橋的長期效果并不令人十分滿意，其10年通暢率最高僅為 70％。術(shù)后隨訪也發(fā)現(xiàn)大隱靜脈作為靜脈橋，血管壁粥樣硬化和再狹窄發(fā)生率遠遠高于動脈橋。近幾年 CABG在我國得到逐漸開展。隨著外科技術(shù)的突飛猛進和實踐經(jīng)驗的積累，人們逐漸認識到就CABG手術(shù)本身，外科熟練精細的操作固然是必不可少，橋血管的選擇和獲

2、取、圍術(shù)期的處理同樣比較重要，是關(guān)系到 CABG 手術(shù)成敗的重要因素之一。既然大隱靜脈并非搭橋手術(shù)理想的選擇，人們轉(zhuǎn)而把目光投向一度被棄之不用的橈動脈。橈動脈作為動脈血管橋可以有效地防止血管壁粥樣硬化；遠、近期通暢率高；游離后橈動脈血管長度合適，內(nèi)徑適中，在手術(shù)中吻合的自由度比較大；橈動脈具有良好彈性，因此可以較好耐受體循環(huán)的壓力；并且獲取血管后前臂的并發(fā)癥也比較少。但是橈動脈也存在著易于痙攣等缺點難以解決。導致橈動脈血管壁發(fā)生痙攣的確

3、切原因還不清楚。目前認為是手術(shù)時機械牽拉損傷、血管壁局部缺血、血管局部活性物質(zhì)釋放、神經(jīng)體液與內(nèi)分泌等因素的改變、對藥物的敏感性不同、術(shù)中血壓不穩(wěn)定影響血管灌注流量、血管被動擴張等因素綜合作用的結(jié)果。但是也和橈動脈血管壁結(jié)構(gòu)及生理等內(nèi)在原因密不可分。為此，臨床醫(yī)生們引入了血管活性藥物來預防和治療血管壁的痙攣。本實驗研究的目的，就是摸索和驗證治療血管痙攣最佳的血管活性藥物或藥物組合的成分、濃度、給藥時機和最終效果。為今后的臨床實踐打好基礎(chǔ)

4、和做好前期工作，摸索一定的經(jīng)驗。另外，許多研究表明，CABG 術(shù)后橈動脈血管壁痙攣的發(fā)生與橈動脈血管壁一氧化氮(NO)的含量異常相關(guān)。我們通過實驗首先建立兔股動脈—頸動脈 CABG 血管橋模型，然后通過基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)，將 eNOS 基因轉(zhuǎn)染到橋血管上并從不同角度證明轉(zhuǎn)染效果。接著通過實驗對比轉(zhuǎn)染前后橋血管痙攣性的變化，探索 eNOS基因轉(zhuǎn)染對動脈血管壁痙攣性的影響(對于預防和治療動脈血管壁痙攣的可行性及有效性)，為臨床應用基因治療提供理

5、論依據(jù)。全文共由四部分組成。 第一部分: 橋血管體外藥物敏感實驗模型的建立血管組織在體內(nèi)處于復雜多變的內(nèi)環(huán)境中，受到來自各方面影響和作用。因此在體研究血管組織收縮痙攣的病因、機理和防治措施，不能保證單一實驗影響因素對血管壁的作用，不同組別相互之間的可比較性差，實驗結(jié)果難以令人信服。在這一部分里，我們評估并獲取人橈動脈，分割成 3mm 寬的血管環(huán)，懸掛至麥氏浴槽上，并連接記錄靜息張力等實驗數(shù)據(jù)的設備。利用組織浴槽的實驗技術(shù)

6、和經(jīng)驗，觀察不同藥物因素對血管環(huán)靜息收縮張力大小的影響及變化。摸索一種比較完善的，能夠盡可能地模擬橋血管在體內(nèi)反應性的實驗裝置。同時繪制人橈動脈對特定血管活性藥物的“濃度-靜息張力變化曲線”，以確定后續(xù)實驗所需藥物的最佳刺激濃度。并利用此裝置檢測血管內(nèi)膜的完整性和對血管活性藥物的反應性。為下一步實驗摸索經(jīng)驗，做好預實驗和實驗設備方面的準備。 第二部分: 不同影響因素對橋血管的影響程度及橋血管痙攣因素分析在這一部分，我們分

7、別討論不同藥物影響因素對橈動脈痙攣性的影響。探討不同藥物或藥物組合對血管痙攣的預防和治療的方法。我們利用前一部分實驗建立的實驗模型，繼續(xù)獲取人橈動脈，采用同實驗第一部分的方法制備成血管環(huán)，懸掛至組織浴槽上，檢測血管壁平滑肌活性和血管內(nèi)膜完整性后進行如下實驗：首先，血管環(huán)由 10<'-5>M 苯腎上腺素致痙攣后，分別加入一定濃度的硝酸甘油、維拉帕米、罌粟堿、酚芐明、米力農(nóng)、以及硝酸甘油和維拉帕米的混合液，觀察上述藥物加入后，隨時間延長各組

8、血管壁痙攣的緩解情況(緩解速度和效果)，記錄靜息收縮張力變化。接著，選取硝酸甘油、維拉帕米、罌粟堿、酚芐明和硝酸甘油與維拉帕米的混合液作為實驗藥物，應用上述藥物浸泡血管環(huán) 30 分鐘(血管環(huán)預處理)，然后在水浴管中加入 KCl，使終濃度達到 60mmol/L，即時觀測各組血管環(huán)收縮產(chǎn)生的程度和情況。最后，血管環(huán)同樣經(jīng)過上述不同藥物預處理 30min后，懸掛至麥氏浴槽，加入 10<'-5>M 的苯腎上腺素，觀察在加入苯腎上腺素后，上述各組

9、血管環(huán)隨時間的延長出現(xiàn)痙攣的時程和程度。借助此實驗為臨床給藥時機提供指導意見。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述幾種血管舒張藥物都能在不同的時間范圍之內(nèi)緩解血管環(huán)的痙攣，但緩解的速度和一定時間內(nèi)緩解的程度不同。硝酸甘油與維拉帕米的混合液緩解血管環(huán)痙攣最為迅速(P<0.05)，其余藥物緩解血管痙攣作用的效能依次是硝酸甘油>維拉帕米>米力農(nóng)>罌粟堿(P<0.05)。酚芐明產(chǎn)生作用最慢，排在最后(P<0.01)。在第二部分預處理實驗中，經(jīng) 60mmol/L 的

10、KCl 刺激后，酚芐明組，維拉帕米組合硝酸甘油與維拉帕米混合液組都僅僅發(fā)生了輕微的收縮。單獨的硝酸甘油組合罌粟堿組則產(chǎn)生了較為明顯的收縮。而在本實驗的最后一部分—藥物作用的時效問題上，經(jīng)藥物預處理 30min 后連續(xù)觀察血管環(huán)靜息張力變化 4 小時，我們發(fā)現(xiàn)預防血管環(huán)痙攣效果最好的藥物是酚芐明，整個實驗過程血管環(huán)都沒有產(chǎn)生收縮；其次是硝酸甘油和維拉帕米的混合液，舒張作用維持了2個小時；米力農(nóng)在痙攣藥的作用下逐漸產(chǎn)生收縮，但最大收縮程度僅

11、為最大靜息張力的 60％；而罌粟堿僅有微弱的預防血管痙攣的作用。通過實驗我們證明，酚芐明和硝酸甘油與維拉帕米的混合液都是比較理想的防止橈動脈痙攣的藥物。前者雖然治療動脈環(huán)痙攣起效較慢，但是在預防血管環(huán)痙攣方面卻能維持4小時以上，作用時間最久；后者在預防血管環(huán)痙攣時程方面稍遜于酚芐明，但卻能迅速有效的緩解和治療血管環(huán)的痙攣。而三者能否再次混合以延長和維持血管的舒張時間，還有待于進一步研究。 第三部分: 內(nèi)皮型一氧化氮合酶基

12、因轉(zhuǎn)染兔頸動脈 CABG模型的實驗研究有實驗證明橈動脈痙攣與其血管壁上內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)數(shù)量相對較少或者活力降低，導致 NO 在局部釋放減少有關(guān)。在此我們嘗試采用轉(zhuǎn)基因的方法，使動脈壁內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)過量表達，通過抑制電壓依賴型和受體依賴型離子通路來減輕痙攣。我們首先嘗試建立兔自體股動脈-頸總動脈 CABG模型。然后以含有人內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因(eNOS基因)的復制缺陷型腺病毒為載體，利用基因轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染

13、人內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因 AdCMV eNOS至兔橋血管(自體股動脈)，飼養(yǎng)4周后處死，獲取目標血管段，分別應用 RT-PCR技術(shù)檢測外源性基因mRNA的表達；用SABC免疫組織化學方法檢測血管壁組織切片上eNOS蛋白、增殖細胞核抗原(PCNA)、平滑肌細胞(纖維)和肌動蛋白(α-acting)；利用 WERSTEN-BLOT 方法半定量檢測 eNOS 蛋白和 PCNA 的含量。將轉(zhuǎn)染后的橋血管與轉(zhuǎn)染前的股動脈相比較，分析觀察 eNOS

14、 表達的定位，eNOS酶活力以及血管壁 NO 含量等指標的變化。探討差別產(chǎn)生的原因、eNOS 基因轉(zhuǎn)染的可行性及有效性，為臨床應用基因治療提供理論依據(jù)。實驗結(jié)果證明，正常兔股動脈血管壁 eNOS 基因僅有少量表達，轉(zhuǎn)染后 eNOS 蛋白表達明顯增多(P<0.01)。血管壁總NOS活力和NO含量也較轉(zhuǎn)染前有明顯增加(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后血管壁內(nèi) PCNA 陽性表達與α-acting 陽性表達明顯少于對照組(P<0.01)。因此本實驗證明

15、可以通過人為基因轉(zhuǎn)染的方法提高目標血管壁 eNOS 基因表達或者eNOS 蛋白產(chǎn)量，進一步增加 NO 濃度。提示可以通過基因轉(zhuǎn)染的辦法解決由于eNOS 基因或 eNOS 缺乏/表達不佳導致的一系列臨床問題。 第四部分: eNOS基因轉(zhuǎn)染后血管壁痙攣性改變的實驗研究傳統(tǒng)的藥物治療不能完全有效地防治動脈橋血管痙攣的發(fā)生。為探求防治橋血管痙攣的有效方法，并證明內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因過量表達，可以通過增加 NO 產(chǎn)量

16、來抑制電壓依賴性和受體依賴性的途徑減輕血管痙攣。我們依照前面介紹的方法首先建立兔股動脈-頸總動脈CABG模型。橋血管(動脈)轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因(eNOS基因)，飼養(yǎng) 4 周后分別獲取目標血管，分別對比觀察橋血管轉(zhuǎn)染eNOS基因前后：1．對在不同濃度苯腎上腺素刺激作用下，導致血管痙攣性的不同反應，比較eNOS基因轉(zhuǎn)染(血管壁 NO 含量不同)對動脈血管壁收縮性質(zhì)的影響；2．經(jīng)過抗痙攣藥物預處理的血管環(huán)在 60 mM KCl 溶液

17、刺激下血管環(huán)的收縮情況；3．應用10<'-5>M 的苯腎上腺素致使血管痙攣，然后應用實驗第二部分介紹的維拉帕米和硝酸甘油混合液作用于血管環(huán)，觀察隨時間延長血管壞痙攣狀況的緩解情況。結(jié)果證明，經(jīng)過轉(zhuǎn)染 eNOS 基因的血管壁無論在血管的收縮性上還是在對血管舒張藥物的敏感性上，都明顯好于未經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的對照組血管(P<0.01)。說明eNOS基因轉(zhuǎn)染可以改善血管壁的痙攣性，有助于減少動脈移植后血管痙攣的發(fā)生。eNOS 基因轉(zhuǎn)染有一定的臨床應用